v*********i
发帖数: 40 | 1 全细胞蛋白做WB。
以前我是这样做的：
转染之后，6 cm 板（5×10^6)直接拿200 ul PBS冲下来，加过量的5 × SDS PAGE
loading buffer （我一般加80 ul），95度煮30 min；然后 13000 rpm 离心 10 min。
基本看不到沉淀。
然后取10 ul 跑胶WB；因为转染起始细胞数目一样，所以基本不调平，看到的beta-
actin就是平的。
现在的老板说我这样做不对，因为没有测蛋白浓度。他要看到我把每个样品的浓度都写
到本子上；还说直接煮不能溶解全部的蛋白（FT）。他很固执，我只好按他的做：
转染之后，6 cm 板用RIPA buffer 800 ul, 加那个Roche Cocktail蛋白酶抑制剂， 冰
上放30 min，然后 13000 rpm 离心 10 min，结果看到大量沉淀。我感觉沉淀跟直接低
速离心收细胞的沉淀差不多。是不是细胞都没破裂啊?
哎，连个成熟的protocol都木有……
谁能给我个完整成熟可靠的呀?说的详细点。
谢谢。
p.s.
我不放心，现在把那个裂解液又拿去超声了；可是超声仪太古老，上面没有能量显示… |
v*********i
发帖数: 40 | |
q******g
发帖数: 3858 | 3 你的第一个方法其实可以。你只要定一下蛋白，知道自己跑了多少微克的蛋白就成了。 |
q******g
发帖数: 3858 | 4 RIPA buffer是比较强的裂解液，容易使细胞核裂解，染色体DNA出来。超声后，DNA断
裂，就看不到那些沉淀了。 |
v*********i
发帖数: 40 | 5 但是加了SDS PAGE loading buffer 还怎么定量呀?
【在 q******g 的大作中提到】
: 你的第一个方法其实可以。你只要定一下蛋白，知道自己跑了多少微克的蛋白就成了。
|
v*********i
发帖数: 40 | 6 这是不是意味着，我看到沉淀那一步，细胞质和核内的蛋白都已经溶解到上清里面了；
并不需要再超声，对吗?
【在 q******g 的大作中提到】
: RIPA buffer是比较强的裂解液，容易使细胞核裂解，染色体DNA出来。超声后，DNA断
: 裂，就看不到那些沉淀了。
|
a***e
发帖数: 1010 | 7 quantitate before adding SDS loading buffer.
【在 v*********i 的大作中提到】
: 但是加了SDS PAGE loading buffer 还怎么定量呀?
|
a***e
发帖数: 1010 | 8 yeah.
for nuclear proteins, some people even add several rounds of freeze-thaw
to increase their release.
【在 v*********i 的大作中提到】
: 这是不是意味着，我看到沉淀那一步，细胞质和核内的蛋白都已经溶解到上清里面了；
: 并不需要再超声，对吗?
|
v*********i
发帖数: 40 | 9 直接煮的话不是PBS悬起来，加了SDS PAGE loading buffer之后，再放到95度煮30min？
那怎么定量呢?
【在 a***e 的大作中提到】
: quantitate before adding SDS loading buffer.
|
s*i
发帖数: 20 | 10 Change boss if you still can, seriously.
What you are doing is ok, you can even skip centrifuging. Sonicating and
heating in SDS buffer is enough.
【在 v*********i 的大作中提到】
: 全细胞蛋白做WB。
: 以前我是这样做的：
: 转染之后，6 cm 板（5×10^6)直接拿200 ul PBS冲下来，加过量的5 × SDS PAGE
: loading buffer （我一般加80 ul），95度煮30 min；然后 13000 rpm 离心 10 min。
: 基本看不到沉淀。
: 然后取10 ul 跑胶WB；因为转染起始细胞数目一样，所以基本不调平，看到的beta-
: actin就是平的。
: 现在的老板说我这样做不对，因为没有测蛋白浓度。他要看到我把每个样品的浓度都写
: 到本子上；还说直接煮不能溶解全部的蛋白（FT）。他很固执，我只好按他的做：
: 转染之后，6 cm 板用RIPA buffer 800 ul, 加那个Roche Cocktail蛋白酶抑制剂， 冰
|
|
|
y***k
发帖数: 60 | 11 你这么做没办法测蛋白浓度吧，只能直接跑胶看看内参平不平
30min？
【在 v*********i 的大作中提到】
: 直接煮的话不是PBS悬起来，加了SDS PAGE loading buffer之后，再放到95度煮30min？
: 那怎么定量呢?
|
a*****n
发帖数: 2835 | 12 两种方法都没有问题
这种实验你自己看文献就能解决
不一定都要定蛋白浓度，定量作不好也定不准，一般的时间就是比较相对的量，所以只
要上样一样多就行了
【在 v*********i 的大作中提到】
: 全细胞蛋白做WB。
: 以前我是这样做的：
: 转染之后，6 cm 板（5×10^6)直接拿200 ul PBS冲下来，加过量的5 × SDS PAGE
: loading buffer （我一般加80 ul），95度煮30 min；然后 13000 rpm 离心 10 min。
: 基本看不到沉淀。
: 然后取10 ul 跑胶WB；因为转染起始细胞数目一样，所以基本不调平，看到的beta-
: actin就是平的。
: 现在的老板说我这样做不对，因为没有测蛋白浓度。他要看到我把每个样品的浓度都写
: 到本子上；还说直接煮不能溶解全部的蛋白（FT）。他很固执，我只好按他的做：
: 转染之后，6 cm 板用RIPA buffer 800 ul, 加那个Roche Cocktail蛋白酶抑制剂， 冰
|
v*********i
发帖数: 40 | 13 是的耶。其实根据原理自己也能判断我的做法应该没问题；而且以前、别人都是这么做
的。
我郁闷的是老板说我这么做不对，还指责我，还说你要是不会做就问问其他人，看看人
家是怎么做的。可是我明明会做，而且做的是对的。
所以想发上来让大家评评理。
我直接加SDS PAGE loading buffer到PBS悬起来的细胞里面煮，老板一听就说怎么能这
么做，你这么做是错的……不能用SDS loading buffer，这个是跑胶的时候上样用的，
你提细胞里的蛋白得用RIPA buffer。
还说，你怎么不加蛋白酶抑制剂。我解释说里面有高浓度的SDS，再煮过，不需要加蛋
白酶抑制剂了，因为蛋白酶已经变性了呀（我的解释对不对??????）
可是老板说做蛋白都得加蛋白酶抑制剂，你不是说自己以前做过很多蛋白质实验吗，你
要是没做过就说没做过，我可以让其他人教你，你要是不知道怎么做，要主动问别人，
看看人家怎么做的，等等。
还说，你怎么不测蛋白浓度；我就解释说我觉得不需要测蛋白浓度，以前我都不测，因
为转染的时候起始细胞数量是一样的，蛋白量应该差不多，加actin内参看一看就应该
知道平不平了；另外加了SD |
v*********i
发帖数: 40 | 14 还有
如果真的需要超声，一般怎么设置呀? 超多久停多久，一共多久；需要多大的能量。
谢谢。 |
v*********i
发帖数: 40 | 15 木有人告诉我超声该怎么设置……
我自己回复一下。 |
a*****n
发帖数: 2835 | 16 什么乱七八招的
听你老板的就是了，反正他说得方法也没有错
【在 v*********i 的大作中提到】
: 是的耶。其实根据原理自己也能判断我的做法应该没问题；而且以前、别人都是这么做
: 的。
: 我郁闷的是老板说我这么做不对，还指责我，还说你要是不会做就问问其他人，看看人
: 家是怎么做的。可是我明明会做，而且做的是对的。
: 所以想发上来让大家评评理。
: 我直接加SDS PAGE loading buffer到PBS悬起来的细胞里面煮，老板一听就说怎么能这
: 么做，你这么做是错的……不能用SDS loading buffer，这个是跑胶的时候上样用的，
: 你提细胞里的蛋白得用RIPA buffer。
: 还说，你怎么不加蛋白酶抑制剂。我解释说里面有高浓度的SDS，再煮过，不需要加蛋
: 白酶抑制剂了，因为蛋白酶已经变性了呀（我的解释对不对??????）
|
v*********i
发帖数: 40 | 17 那要是超声滴话，怎么设置呢?
多大能量，多长时间，超多久停多久，一共超声多久，etc。
谢谢哎 |
f********7
发帖数: 59 | 18 你老板有病，故意找茬。
【在 v*********i 的大作中提到】
: 是的耶。其实根据原理自己也能判断我的做法应该没问题；而且以前、别人都是这么做
: 的。
: 我郁闷的是老板说我这么做不对，还指责我，还说你要是不会做就问问其他人，看看人
: 家是怎么做的。可是我明明会做，而且做的是对的。
: 所以想发上来让大家评评理。
: 我直接加SDS PAGE loading buffer到PBS悬起来的细胞里面煮，老板一听就说怎么能这
: 么做，你这么做是错的……不能用SDS loading buffer，这个是跑胶的时候上样用的，
: 你提细胞里的蛋白得用RIPA buffer。
: 还说，你怎么不加蛋白酶抑制剂。我解释说里面有高浓度的SDS，再煮过，不需要加蛋
: 白酶抑制剂了，因为蛋白酶已经变性了呀（我的解释对不对??????）
|
a*****n
发帖数: 2835 | 19 一般不用超升，超升是为了打碎DNA
【在 v*********i 的大作中提到】
: 那要是超声滴话，怎么设置呢?
: 多大能量，多长时间，超多久停多久，一共超声多久，etc。
: 谢谢哎
|
y***k
发帖数: 60 | 20 你老板很tough啊，尽量少和他顶嘴，就按他说的做好了
【在 v*********i 的大作中提到】
: 是的耶。其实根据原理自己也能判断我的做法应该没问题；而且以前、别人都是这么做
: 的。
: 我郁闷的是老板说我这么做不对，还指责我，还说你要是不会做就问问其他人，看看人
: 家是怎么做的。可是我明明会做，而且做的是对的。
: 所以想发上来让大家评评理。
: 我直接加SDS PAGE loading buffer到PBS悬起来的细胞里面煮，老板一听就说怎么能这
: 么做，你这么做是错的……不能用SDS loading buffer，这个是跑胶的时候上样用的，
: 你提细胞里的蛋白得用RIPA buffer。
: 还说，你怎么不加蛋白酶抑制剂。我解释说里面有高浓度的SDS，再煮过，不需要加蛋
: 白酶抑制剂了，因为蛋白酶已经变性了呀（我的解释对不对??????）
|
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 21 你的方法没有问题，大部分实验室都这么做的。但是我不建议你和老板顶牛，你最好是
要分清矛盾的主次，不要为了这种小事情和他翻脸。
用RIPA buffer 并不能保证所有蛋白都溶解，而且里面的detergent 会干扰
Bradford protein assay,这个在大部分bradford assay的技术说明书里会提到。
你可以拿一个已知浓度的蛋白(such as BSA)，一半溶在PBS, 一般溶在RIPA buffer,
然后做这个Bradford assay, 体会一下，
你会发现溶在RIPA buffer 里的蛋白的数值和PBS里的不一样，而且仪器上
读出来的数值不稳定，每次重复测量读出来的数值都大大的不同。
注意先不要告诉老板！先自己偷偷做一个，心里有数，然后再跟老板讨论，装作
谦虚的说你听说RIPA buffer 有这个问题，然后建议你们作这个实验，然后
再当面重新作一次给他看. 注意这个顺序不能颠倒！一定要自己先做一次，知道
结果了，然后才装着和他讨论装着你是第一次做这个实验。
千万千万不要直接第一次就作给他看！否则万一你们的蛋白有问题，
或者你们的UV spec 有问
【在 v*********i 的大作中提到】
: 全细胞蛋白做WB。
: 以前我是这样做的：
: 转染之后，6 cm 板（5×10^6)直接拿200 ul PBS冲下来，加过量的5 × SDS PAGE
: loading buffer （我一般加80 ul），95度煮30 min；然后 13000 rpm 离心 10 min。
: 基本看不到沉淀。
: 然后取10 ul 跑胶WB；因为转染起始细胞数目一样，所以基本不调平，看到的beta-
: actin就是平的。
: 现在的老板说我这样做不对，因为没有测蛋白浓度。他要看到我把每个样品的浓度都写
: 到本子上；还说直接煮不能溶解全部的蛋白（FT）。他很固执，我只好按他的做：
: 转染之后，6 cm 板用RIPA buffer 800 ul, 加那个Roche Cocktail蛋白酶抑制剂， 冰
|
j*****a
发帖数: 658 | 22 我觉得可以用RIPA + lowery assay or RIPA + BCA assay。 这两个assay，公司的说
明书上都说是detergent compatible的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的方法没有问题，大部分实验室都这么做的。但是我不建议你和老板顶牛，你最好是
: 要分清矛盾的主次，不要为了这种小事情和他翻脸。
: 用RIPA buffer 并不能保证所有蛋白都溶解，而且里面的detergent 会干扰
: Bradford protein assay,这个在大部分bradford assay的技术说明书里会提到。
: 你可以拿一个已知浓度的蛋白(such as BSA)，一半溶在PBS, 一般溶在RIPA buffer,
: 然后做这个Bradford assay, 体会一下，
: 你会发现溶在RIPA buffer 里的蛋白的数值和PBS里的不一样，而且仪器上
: 读出来的数值不稳定，每次重复测量读出来的数值都大大的不同。
: 注意先不要告诉老板！先自己偷偷做一个，心里有数，然后再跟老板讨论，装作
: 谦虚的说你听说RIPA buffer 有这个问题，然后建议你们作这个实验，然后
|
j*****a
发帖数: 658 | 23 nodding
【在 a*****n 的大作中提到】
: 一般不用超升，超升是为了打碎DNA
|
j*****a
发帖数: 658 | 24 1。 proteinase inhibitor cocktail and phosphatase inhibitors 是要加的。他们
的作用是防止你在抽提蛋白的过程中蛋白讲解。在你一开始用pbs悬细胞的时候，如果
不加这两种抑制剂，会有蛋白降解。一般我洗细胞的时候就开始加。当然蛋白煮过变性
就不存在这个问题了。
2。 你的方法当然是可行的。5x sds page loading buffer 里就有detergent SDS，然
后再加热裂解，当然没错。如果你对自己的手平行操作非常confident，是完全可以不
测蛋白浓度的，直接加热完后run gel。 其实测蛋白的时候如果做的好一般情况下，
sample和sample之间浓度都是差不多的，校正和不校正是没有很大差的。所以你的做法
没有啥不对。只是你老板的做法是小学生式的，step by step, 也是classic的做法。
3. RIPA buffer是很强的裂解液，里面有几种detergent 组合，所以一般情况下裂解是
很完全的。就像上面的人说的，超声主要是打碎DNA，有点牛刀杀鸡了。
4。关于loading contro
【在 v*********i 的大作中提到】
: 是的耶。其实根据原理自己也能判断我的做法应该没问题；而且以前、别人都是这么做
: 的。
: 我郁闷的是老板说我这么做不对，还指责我，还说你要是不会做就问问其他人，看看人
: 家是怎么做的。可是我明明会做，而且做的是对的。
: 所以想发上来让大家评评理。
: 我直接加SDS PAGE loading buffer到PBS悬起来的细胞里面煮，老板一听就说怎么能这
: 么做，你这么做是错的……不能用SDS loading buffer，这个是跑胶的时候上样用的，
: 你提细胞里的蛋白得用RIPA buffer。
: 还说，你怎么不加蛋白酶抑制剂。我解释说里面有高浓度的SDS，再煮过，不需要加蛋
: 白酶抑制剂了，因为蛋白酶已经变性了呀（我的解释对不对??????）
|
a****d
发帖数: 1919 | 25 Good summary!
【在 j*****a 的大作中提到】
: 1。 proteinase inhibitor cocktail and phosphatase inhibitors 是要加的。他们
: 的作用是防止你在抽提蛋白的过程中蛋白讲解。在你一开始用pbs悬细胞的时候，如果
: 不加这两种抑制剂，会有蛋白降解。一般我洗细胞的时候就开始加。当然蛋白煮过变性
: 就不存在这个问题了。
: 2。 你的方法当然是可行的。5x sds page loading buffer 里就有detergent SDS，然
: 后再加热裂解，当然没错。如果你对自己的手平行操作非常confident，是完全可以不
: 测蛋白浓度的，直接加热完后run gel。 其实测蛋白的时候如果做的好一般情况下，
: sample和sample之间浓度都是差不多的，校正和不校正是没有很大差的。所以你的做法
: 没有啥不对。只是你老板的做法是小学生式的，step by step, 也是classic的做法。
: 3. RIPA buffer是很强的裂解液，里面有几种detergent 组合，所以一般情况下裂解是
|
T**********t
发帖数: 1604 | 26 你最好找到你那台老式超声仪的说明书看看输出能量是多少，找不到说明书的话，根据
型号google一下说不定能找到有用的信息。
【在 v*********i 的大作中提到】
: 那要是超声滴话，怎么设置呢?
: 多大能量，多长时间，超多久停多久，一共超声多久，etc。
: 谢谢哎
|
s*****g
发帖数: 7857 | 27 cell signaling # 9803
Cell Lysis Buffer (10X)
____________
1X Cell Lysis Buffer:
20 mM Tris-HCl (pH 7.5)
150 mM NaCl
1 mM Na2EDTA
1 mM EGTA
1% Triton
2.5 mM sodium pyrophosphate
1 mM b-glycerophosphate
1 mM Na3VO4
1 μg/ml leupeptin
adding 1 mM PMSF immediately before use. |
h**2
发帖数: 2841 | 28 老弟/老妹，很多实验室都有自己的习惯，尤其是你做phd的话人家assume你是张白纸，
谦虚小心点follow他们的习惯总不会错。
虽然你的这个实验beta actin是匀的，但对于你的这个方法对establish自己的实验系
统很不好。
首先以后你可能会碰到细胞数在transfection/infection之后变化很多，其次你用pbs
冲下来的话也可能漏掉一些，这些都是很可能的，实验多了的话难免出错，但你最快也
要等到running/transferring之后用ponceau S才能知道，浪费时间啊。至于裂解的话
找个标准的protocol用RIPA来做吧，算是经典方法之一，不想配的话公司有卖的。记得
加上protease inhibitor和phoshpatase inhibitor (thermo)也有卖的
我老板平时都不管学生，但每个新生进实验室一般迟早都会被骂一次，算是整个phd培
养过程唯一一次micro-management，常常会说it's scientific research, not
cooking!开始也有点不服气，但后来慢慢意识到每一步仔细一点，其实整体上
【在 v*********i 的大作中提到】
: 全细胞蛋白做WB。
: 以前我是这样做的：
: 转染之后，6 cm 板（5×10^6)直接拿200 ul PBS冲下来，加过量的5 × SDS PAGE
: loading buffer （我一般加80 ul），95度煮30 min；然后 13000 rpm 离心 10 min。
: 基本看不到沉淀。
: 然后取10 ul 跑胶WB；因为转染起始细胞数目一样，所以基本不调平，看到的beta-
: actin就是平的。
: 现在的老板说我这样做不对，因为没有测蛋白浓度。他要看到我把每个样品的浓度都写
: 到本子上；还说直接煮不能溶解全部的蛋白（FT）。他很固执，我只好按他的做：
: 转染之后，6 cm 板用RIPA buffer 800 ul, 加那个Roche Cocktail蛋白酶抑制剂， 冰
|
h**2
发帖数: 2841 | 29 我觉得你们实验室肯定有成熟的protocol，我这就给你一个我们的RIPA Whole Cell
Extracts protocol吧，用了20年应该不止了 hh
6-well为例
细胞用~1 ml chilled PBS洗一遍
加600 ul 冰PBS，用scraper刮下来，transfer to eppendorf tube
3000 rpm 4C离心3~5min，去上清
离心的同时准备RIPA buffer，我们用的是thermo scientific的Halt protease和
phosphatase inhibitor 100x cocktail
根据cell pellet大小加适量RIPA，一般35mm well的话65~120 ul差不多了，pipetting
up and down till the pellet dissolves，有的细胞蛋白或者DNA content比较高感
觉会比较粘稠，适量增加一点RIPA
拿去sonicate，break genomic DNA，program的话因sonicator而异，不过你不做ChIP
的话问题不大，每个tube s
【在 v*********i 的大作中提到】
: 全细胞蛋白做WB。
: 以前我是这样做的：
: 转染之后，6 cm 板（5×10^6)直接拿200 ul PBS冲下来，加过量的5 × SDS PAGE
: loading buffer （我一般加80 ul），95度煮30 min；然后 13000 rpm 离心 10 min。
: 基本看不到沉淀。
: 然后取10 ul 跑胶WB；因为转染起始细胞数目一样，所以基本不调平，看到的beta-
: actin就是平的。
: 现在的老板说我这样做不对，因为没有测蛋白浓度。他要看到我把每个样品的浓度都写
: 到本子上；还说直接煮不能溶解全部的蛋白（FT）。他很固执，我只好按他的做：
: 转染之后，6 cm 板用RIPA buffer 800 ul, 加那个Roche Cocktail蛋白酶抑制剂， 冰
|
s******r
发帖数: 2876 | 30 35 mm才用100 ul，
那一般浓度范围多少？
loading多少蛋白/well？
我觉得你们实验室肯定有成熟的protocol，我这就给你一个我们的RIPA Whole Cell
Extracts protocol吧，用了20年应该不止了 hh
6-well为例
细胞用~1 ml chilled PBS洗一遍
加600 ul 冰PBS，用scraper刮下来，transfer to eppendorf tube
3000 rpm 4C离心3~5min，去上清
离心的同时准备RIPA buffer，我们用的是thermo scientific的Halt protease和
phosphatase inhibitor 100x cocktail
根据cell pellet大小加适量RIPA，一般35mm well的话65~120 ul差不多了，pipetting
up and down till the pellet dissolves，有的细胞蛋白或者DNA content比较高感
觉会比较粘稠，适量增加一点RIPA
拿去sonicate，break genomic DNA，pr
【在 h**2 的大作中提到】
: 我觉得你们实验室肯定有成熟的protocol，我这就给你一个我们的RIPA Whole Cell
: Extracts protocol吧，用了20年应该不止了 hh
: 6-well为例
: 细胞用~1 ml chilled PBS洗一遍
: 加600 ul 冰PBS，用scraper刮下来，transfer to eppendorf tube
: 3000 rpm 4C离心3~5min，去上清
: 离心的同时准备RIPA buffer，我们用的是thermo scientific的Halt protease和
: phosphatase inhibitor 100x cocktail
: 根据cell pellet大小加适量RIPA，一般35mm well的话65~120 ul差不多了，pipetting
: up and down till the pellet dissolves，有的细胞蛋白或者DNA content比较高感
|
|
|
h**2
发帖数: 2841 | 31 我们的实验一般细胞都不能太confluent，一般65~90%吧
WCE protein concentration如果用100 ul的RIPA的话有1~2 ug/ul，不过这个跟我们的
spectrometer有关，我们一般1:400 dilute，终浓度太稀的话reading unreliable
Loading的蛋白量的话就根据看什么了，一些oncogene或者tumor suppressor的话我喜
欢10~30 ug，不过30 ug WCE的actin 1:10k，20 min还是太深了，我有时候用tubulin 1:10k，15 min好一点
BioRad的那套东西，15-tooth standard comb的话max应该是55 ul, 10-tooth好像可以
load 80 ul吧？
【在 s******r 的大作中提到】
: 35 mm才用100 ul，
: 那一般浓度范围多少？
: loading多少蛋白/well？
:
: 我觉得你们实验室肯定有成熟的protocol，我这就给你一个我们的RIPA Whole Cell
: Extracts protocol吧，用了20年应该不止了 hh
: 6-well为例
: 细胞用~1 ml chilled PBS洗一遍
: 加600 ul 冰PBS，用scraper刮下来，transfer to eppendorf tube
: 3000 rpm 4C离心3~5min，去上清
|
