m****m 发帖数: 395 | 1 想看看提纯后的蛋白里有没有杂蛋白,请问10孔12%的SDSPAGE胶,每孔应该上样多少ug
呢?
(我知道一个孔最多上20ul,这样的话我是把蛋白稀释一点成20ul后上样好呢?还是不
要太稀释上5-10ul就好了?)先告诉我上多少 UG 蛋白吧,目的是看纯度,是不是该多
上点,但是又不希望太多,难看又影响分辨率还不容易分开。谢谢指教! |
h******y 发帖数: 1374 | 2 loading volume should depend on the thickness of the gel, right?
ug
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想看看提纯后的蛋白里有没有杂蛋白,请问10孔12%的SDSPAGE胶,每孔应该上样多少ug : 呢? : (我知道一个孔最多上20ul,这样的话我是把蛋白稀释一点成20ul后上样好呢?还是不 : 要太稀释上5-10ul就好了?)先告诉我上多少 UG 蛋白吧,目的是看纯度,是不是该多 : 上点,但是又不希望太多,难看又影响分辨率还不容易分开。谢谢指教!
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e****s 发帖数: 1125 | 3 一般是5ug左右就好了,和体积没啥关系。
ug
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想看看提纯后的蛋白里有没有杂蛋白,请问10孔12%的SDSPAGE胶,每孔应该上样多少ug : 呢? : (我知道一个孔最多上20ul,这样的话我是把蛋白稀释一点成20ul后上样好呢?还是不 : 要太稀释上5-10ul就好了?)先告诉我上多少 UG 蛋白吧,目的是看纯度,是不是该多 : 上点,但是又不希望太多,难看又影响分辨率还不容易分开。谢谢指教!
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s****l 发帖数: 395 | 4 这问题太tricky了,我以前都load好多(20ug),可以看到很多杂拌,但是主band太明显了(
已经饱和了),结果被committee批评说提蛋白水平太差,蛋白太不纯.
结果我就老实了,按照paper上别人load的强度,同样的sample,我load 1ug后就剩下1条
主band,然后大家都很开心的说蛋白很纯一条带. 所以我觉得最好做个梯度, 从0.5ug到
20ug, 自己清楚一个purity,给别人show另一个purity.
ug
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想看看提纯后的蛋白里有没有杂蛋白,请问10孔12%的SDSPAGE胶,每孔应该上样多少ug : 呢? : (我知道一个孔最多上20ul,这样的话我是把蛋白稀释一点成20ul后上样好呢?还是不 : 要太稀释上5-10ul就好了?)先告诉我上多少 UG 蛋白吧,目的是看纯度,是不是该多 : 上点,但是又不希望太多,难看又影响分辨率还不容易分开。谢谢指教!
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m****m 发帖数: 395 | 5 说得有理。但是我现在得对自己负责,我提纯了要测结构的,所以一定要看到杂的是不
是多。但是不是总是不可能100%纯呢?
了(
【在 s****l 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这问题太tricky了,我以前都load好多(20ug),可以看到很多杂拌,但是主band太明显了( : 已经饱和了),结果被committee批评说提蛋白水平太差,蛋白太不纯. : 结果我就老实了,按照paper上别人load的强度,同样的sample,我load 1ug后就剩下1条 : 主band,然后大家都很开心的说蛋白很纯一条带. 所以我觉得最好做个梯度, 从0.5ug到 : 20ug, 自己清楚一个purity,给别人show另一个purity. : : ug
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W*********e 发帖数: 247 | 6 你这种情况上样多点没啥坏处啊, 难道担心你的蛋白和杂蛋白在胶上分不开?
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 说得有理。但是我现在得对自己负责,我提纯了要测结构的,所以一定要看到杂的是不 : 是多。但是不是总是不可能100%纯呢? : : 了(
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p******i 发帖数: 1092 | 7 貌似可以切膠再去測MS?
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 说得有理。但是我现在得对自己负责,我提纯了要测结构的,所以一定要看到杂的是不 : 是多。但是不是总是不可能100%纯呢? : : 了(
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a***a 发帖数: 40617 | 8 initial screening 90% purity就可以
一般commassie blue stain肉眼能看到的量大概是0.5ug
换句话说你至少要load 5ug以上
你送去给人做结构的样品一般至少要浓缩到10mg/ml以上
跑1ul样品就可以了,根本不用考虑上样体积
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m****m 发帖数: 395 | 9 可以,但是LAB MANAGER不同意,说耗费用
【在 p******i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 貌似可以切膠再去測MS?
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n****e 发帖数: 1677 | 10 晶体结构?还是光谱之类的?蛋白哪有100%纯的,多load点肯定会看到杂带,即使少
load,也可以用不同的染色法看到杂带,比如silver stain.
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 说得有理。但是我现在得对自己负责,我提纯了要测结构的,所以一定要看到杂的是不 : 是多。但是不是总是不可能100%纯呢? : : 了(
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j*********n 发帖数: 168 | 11 如果对蛋白的纯度还没准确测量,那就分别上5、10、15(加了loading buffer)后的
,大致估一下,下次照此办理……
细胞裂解的上清,杂蛋白比较多,可以稍微少上点样;经过凝胶柱或者离子交换提纯的
,要少上些……
跟做菜一样,放多少盐,你自己嘴巴尝尝就有数了……
当然,你得先会做菜。
你问的好几个蛋白分离,检查的问题都很入门啊,不是入错了行吧…… |