C*****h
发帖数: 926 | 1 用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
不知道是怎么回事？
0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
转染1x10^5细胞。
不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
看目标蛋白是不是减少了。
可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
总个western blot还剩下99％的蛋白质。
有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 我用的是embryonic fibroblast, 和3T3差不多。
一般都能做到20%。 再高就没有办法了。
基本上，你要确认两件事：
1。你提的DNA足够纯。如果不放心的话，可以用ethanol/NaAc 沉淀法
纯化一次
2。细胞的状态。 必须在60~80% confluence 之间。
如果都不行的话，还有一个不是办法的办法，
那就是把细胞trpsinized, wash, resuspend, 然后在细胞贴壁之前
把转染混合物加进去。因为细胞在spread and adhere 的时候会吸进很多
vesicle.相当于就是强行把DNA弄进去了。不过这个方法会弄死很多细胞。
谢。
【在 C*****h 的大作中提到】
: 用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
: 不知道是怎么回事？
: 0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
: 转染1x10^5细胞。
: 不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
: 我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
: 看目标蛋白是不是减少了。
: 可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
: 总个western blot还剩下99％的蛋白质。
: 有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。
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l*********i
发帖数: 10 | 3 用fugene转（英文名字忘了拼写了）。lipo毒性太大，
谢。
【在 C*****h 的大作中提到】
: 用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
: 不知道是怎么回事？
: 0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
: 转染1x10^5细胞。
: 不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
: 我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
: 看目标蛋白是不是减少了。
: 可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
: 总个western blot还剩下99％的蛋白质。
: 有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。
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T****r
发帖数: 4006 | 4 shRNA vector有puromycin selection? 用药晒一下...
不然就用lentiviral shRNA vector, 直接做成virus 转染.... |
w******e
发帖数: 1187 | 5 sunnyday zhenshi shiyan baodian ...
【在 s******y 的大作中提到】
: 我用的是embryonic fibroblast, 和3T3差不多。
: 一般都能做到20%。 再高就没有办法了。
: 基本上，你要确认两件事：
: 1。你提的DNA足够纯。如果不放心的话，可以用ethanol/NaAc 沉淀法
: 纯化一次
: 2。细胞的状态。 必须在60~80% confluence 之间。
: 如果都不行的话，还有一个不是办法的办法，
: 那就是把细胞trpsinized, wash, resuspend, 然后在细胞贴壁之前
: 把转染混合物加进去。因为细胞在spread and adhere 的时候会吸进很多
: vesicle.相当于就是强行把DNA弄进去了。不过这个方法会弄死很多细胞。
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a*****n
发帖数: 2835 | 6 shRNA还是做成virus比较有效，siRNA有专门的转染试剂效率很高
谢。
【在 C*****h 的大作中提到】
: 用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
: 不知道是怎么回事？
: 0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
: 转染1x10^5细胞。
: 不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
: 我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
: 看目标蛋白是不是减少了。
: 可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
: 总个western blot还剩下99％的蛋白质。
: 有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。
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a****d
发帖数: 1919 | 7 I use lentivirus to make sure high efficiency of transfection. |
s******y
发帖数: 28562 | 8 没有办法，千老作的太久了，什么试验都作过，什么技术都知道一点，
我现在都想我是不是该出一本试验手册拿去卖了。哈哈哈
【在 w******e 的大作中提到】
: sunnyday zhenshi shiyan baodian ...
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s******r
发帖数: 2876 | 9 你应该开一个公司做试验。
没有办法，千老作的太久了，什么试验都作过，什么技术都知道一点，
我现在都想我是不是该出一本试验手册拿去卖了。哈哈哈
【在 s******y 的大作中提到】
: 没有办法，千老作的太久了，什么试验都作过，什么技术都知道一点，
: 我现在都想我是不是该出一本试验手册拿去卖了。哈哈哈
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n******d
发帖数: 1055 | 10 欣赏你
【在 T****r 的大作中提到】
: shRNA vector有puromycin selection? 用药晒一下...
: 不然就用lentiviral shRNA vector, 直接做成virus 转染....
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w***a
发帖数: 4361 | 11 试过electroporation么？
俺电转过siRNA到differentiated adipocytes，转完以后细胞挂了一些，但剩下的
knockdown effect可以到80%以上。
谢。
【在 C*****h 的大作中提到】
: 用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
: 不知道是怎么回事？
: 0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
: 转染1x10^5细胞。
: 不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
: 我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
: 看目标蛋白是不是减少了。
: 可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
: 总个western blot还剩下99％的蛋白质。
: 有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。
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d****d
发帖数: 214 | 12 In my hands and using TransIT-LT1 from Mirus, the tranfection efficiency of
3T3 cells can be as high as 65% for our GFP expressing reporter plasmid. The
transfection efficiency of 3T3 cells can be as high as 90% using Neon
electroporation system, although only ~20% cells survived the procedure. The
transfection efficiency is derived from flow cytometry data. It could be
lower if you just look at the cells under microscope. |
p******i
发帖数: 1092 | 13 对，病毒最狠，
不过你貌似需要LICENSE和LEVEL II的HOOD？
【在 T****r 的大作中提到】
: shRNA vector有puromycin selection? 用药晒一下...
: 不然就用lentiviral shRNA vector, 直接做成virus 转染....
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i***R
发帖数: 663 | 14 我用过电转siRNA，效率可达90% 以上。
操作很简单，就是需要找到有设备的实验室。
谢。
【在 C*****h 的大作中提到】
: 用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
: 不知道是怎么回事？
: 0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
: 转染1x10^5细胞。
: 不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
: 我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
: 看目标蛋白是不是减少了。
: 可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
: 总个western blot还剩下99％的蛋白质。
: 有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。
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T****r
发帖数: 4006 | 15 我呆过实验室，只要做细胞的，一般使用的hood都可以操作...
【在 p******i 的大作中提到】
: 对，病毒最狠，
: 不过你貌似需要LICENSE和LEVEL II的HOOD？
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w***a
发帖数: 1053 | 16 提高lipo和质粒的ratio，多加点lipo，毒性可能大了些，但是效率会高点。
另外，试试电转，如果还不行就virus吧。 |
C*****h
发帖数: 926 | 17 请看附件上的照片（200x），不知道有多少细胞被转染了？
有没有20％？~100％ confluency
0.8 ug Plasmid DNA + 4 ul Lipofectamine 2000
转染10^5细胞。
谢。
【在 C*****h 的大作中提到】
: 用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
: 不知道是怎么回事？
: 0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
: 转染1x10^5细胞。
: 不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
: 我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
: 看目标蛋白是不是减少了。
: 可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
: 总个western blot还剩下99％的蛋白质。
: 有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。
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s******y
发帖数: 28562 | 18 3T3用化学转染法作到这个程度已经差不多了。
提高的余地不多了。
如果你还想更高的话，只能用电转或者病毒了
【在 C*****h 的大作中提到】
: 请看附件上的照片（200x），不知道有多少细胞被转染了？
: 有没有20％？~100％ confluency
: 0.8 ug Plasmid DNA + 4 ul Lipofectamine 2000
: 转染10^5细胞。
:
: 谢。
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