C*****h
发帖数: 926 | 1 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: Carwash (for+free), 信区: Biology
标 题: 3T3 transfection效率太低
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Apr 28 21:47:39 2010, 美东)
用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
不知道是怎么回事？
0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
转染1x10^5细胞。
不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
看目标蛋白是不是减少了。
可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
总个western blot还剩下99％的蛋白质。
有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 2 用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
不知道是怎么回事？
0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
转染1x10^5细胞。
不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
看目标蛋白是不是减少了。
可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
总个western blot还剩下99％的蛋白质。
有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。 |
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d****d
发帖数: 214 | 3 In my hands and using TransIT-LT1 from Mirus, the tranfection efficiency of
3T3 cells can be as high as 65% for our GFP expressing reporter plasmid. The
transfection efficiency of 3T3 cells can be as high as 90% using Neon
electroporation system, although only ~20% cells survived the procedure. The
transfection efficiency is derived from flow cytometry data. It could be
lower if you just look at the cells under microscope. |
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g*********r
发帖数: 59 | 4 不知到大家熟不熟悉3T3-L1细胞。我试了好多遍EGCG在其adiogensis中的抑制。想用
EGCG作为我试验的对照。每次都发现EGCG显著上调 3T3-L1的adipogenesis。实在郁闷
。多谢了。 |
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g*********r
发帖数: 59 | 5 I chose EGCG as we are interested in food supplement research.EGCG was
chosen for several reasons
1) some papers showed that it could inhibit 3T3-L1 adipogenesis and increase
lipolysis.
2) it has very similar chemical structures to the compounds I am testing.
The 3T3-L1 cells differentiate very well. I treated cells with EGCG in DMEM
+10%FBS for 8 days.
Thanks! |
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S*******C
发帖数: 7325 | 7 哈哈 好的
看完3T3前不能喜欢，原因您知道的。。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 我用的是embryonic fibroblast, 和3T3差不多。
一般都能做到20%。 再高就没有办法了。
基本上，你要确认两件事：
1。你提的DNA足够纯。如果不放心的话，可以用ethanol/NaAc 沉淀法
纯化一次
2。细胞的状态。 必须在60~80% confluence 之间。
如果都不行的话，还有一个不是办法的办法，
那就是把细胞trpsinized, wash, resuspend, 然后在细胞贴壁之前
把转染混合物加进去。因为细胞在spread and adhere 的时候会吸进很多
vesicle.相当于就是强行把DNA弄进去了。不过这个方法会弄死很多细胞。
谢。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 9 3T3用化学转染法作到这个程度已经差不多了。
提高的余地不多了。
如果你还想更高的话，只能用电转或者病毒了 |
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j****g
发帖数: 406 | 10 补充，是NIH/3T3 cells.
culture |
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k****n
发帖数: 158 | 11 请问，用g418筛选稳定转染的3t3一般用多大的浓度，需要多长的时间， 我试了一次用
到500ug/ml，经过了14天，效果不是很好，请问这个细胞有什么要注意的嘛，感觉比
cos7要难筛选很多。
谢谢！ |
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f*******e
发帖数: 354 | 12 我用mef做脂肪分化，KOMEF长的快，分化的好，然而3t3,3t3l1,C3H10T1/2都是RNAi长
的比ctrl慢，rnai剩余30%，也做不出分化差异，本想做做机制。请牛人帮忙解释下，
怎么个情况？
谢谢大家 |
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m********m
发帖数: 263 | 13 不知道lz为什么偏好EGCG来抑制adiogensis，有很多东西可以抑制3T3-L1的
differentiation。 如果lz是要问为什么看到EGCG不能抑制adiogensis， 我没用过，
就不知道了. DMSO，FBS都可以稍微诱导adiogensis， lz是不是没有控制好实验 |
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n********k
发帖数: 2818 | 15 must be a newbie and a bit careless researcher:))) this 3t3 is not that 3t3.
..
? |
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l******g
发帖数: 83 | 16 3T3 用Nocodazole synchronization 的效果是不太好，我以前做的时候，几个cell
line， 3T3 treat后变圆的比例最少。用在Hela 还有293 上效果很好。
%, |
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q**********0
发帖数: 335 | 17 Thanks for the reply. I hear NIH-3T3 has high background, and also NIH-3T3
is immortalized, then how can it will be transformed? Thanks. |
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h******y
发帖数: 351 | 18 你说的比较温和是指什么？
来源于很多组织的人的fibroblast可以通过overexpress hTERT得到immortalization，
这是由于人的fibroblast在体外培养条件下的senescence多是由于端粒渐行缩短而导致
的（telomere-dependent replicative senescence）。与人的fibroblast不同，体外
培养中MEF的senescence并不是由于端粒缩短引起的,而是由于如前所述的过氧基团累积
oxidative stress induced DNA damage。研究表明senescence的MEF的端粒还很长，而
且MEF中有较高的mTERT表达，所以过表达mTERT并不能有效immortalize MEF。因为要抑
制p53和Rb通路，所以表达异源的SV40 T和HPV16 E6/E7都可以immortalize MEF。当然
这样得到的细胞株，由于这些病毒蛋白的过量表达，基因组并不稳定，长久培养会出现
嬗变。
3T3办法引起的自发immortalization实际上主要是由于自发的p53通路抑制（p53 loss... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 谢谢！我的合作者就是用的你贴的3T3方法，但是他们没有弄出来。
我以前也用过3T3方法但是那个是野生型，很容易诱导的。
现在这个KO, 说不定就是如你所言和p53和Rb通路有间接关系，
我为了保险，想用其他方法来诱导，不知道除了用病毒，还有什么其他法子么？
比方说加个什么什么化学品之类的？
如果用病毒的话，是否要用lenti or retro vector? |
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w***r
发帖数: 709 | 20 fibroblast属于原代细胞，没有突变。各种通路正常，可以说是standard,别人容易重复
最初3t3,也是为了有一个标准系。3t3不是原代 |
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J*******a
发帖数: 96 | 21 This is the paper:
Human Milk and Infant Formula Can Induce in Vitro Adipocyte Differentiation
in Murine 3T3-L1 Preadipocytes
Lyle et al. Pediatric Research (1998) 44, 798–803
Not sure the journal is credible or not. Impact factor is only 2.8 or so...
That is not very good at all.
In vitro system is very artificial and very different from in
vivo human development.
Also, it's not "adult milk" but "breast milk" instead (they said it weird in
the paper "human milk"...). So what they really meant w... 阅读全帖 |
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d****h
发帖数: 4291 | 22 如果是这篇文章的话
Human Milk and Infant Formula Can Induce in Vitro Adipocyte Differentiation
in Murine 3T3-L1 Preadipocytes
Lyle et al. Pediatric Research (1998) 44, 798–803
这篇文章我大概扫了一下
先说杂志Pediatric Research 影响影子不到3分，应该是NPG系列（nature系列）杂志
的最烂的期刊，可以没有之一，典型的灌水杂志
再说文章内容
lz解读的有问题，属于有点望文生义，至少对结论有夸大的成分，文章原始结论是促进
脂肪相关基因的表达，准确的说是转录水平而已
文章做的是离体细胞实验，也就是生物上常用的cell line
在培养基上长的细胞的状况和细胞在体内的状况本来就还差的很远的距离，不管是细胞
生长还是分化，离体细胞系和体内都差得很远
活体是不是能促进相关基因的表达，都还不一定能得出同样的结论
如果做药物研究，一般来说，先是细胞实验，其次才是模式动物，也就是通常说的小白
鼠，然后，n多实验之后才是上人体临... 阅读全帖 |
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i********n
发帖数: 171 | 23 send your CV if you think you are an expert in the field. [email protected]/* */
1. Curcumin-loaded Bioinspired Polymeric Nanosystem Enhances the Cell Cycle
Arrest and Cell Apoptosis in Colon Cancer Cells
2.Proliferation-enhancing effects of gastrodin on RSC96 Schwann cells by
regulating ERK1/2 and PI3K signaling pathways
3.MiR-489 suppresses proliferation and invasion of human bladder cancer
cells
4.Combination treatment with Rhizoma Paridis and Rhizoma Curcuma longa
extracts and 10-hydro... 阅读全帖 |
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p*******p
发帖数: 13670 | 24 hand 1
mp2 raise to 3.5x bb, button called， sb call，
flop 3T3, mp2 bet 7bb, hero buttoned, sb fold
turn A, mp2 check, button check
river K, mp2 bet 15bb, button raise to 45bb, mp2 reraise all in (start stack
100bb), button called
what mp2 and button have?
hand 2
utg raise to 2bb, fold to button
flop 9h10sJh
utg bet 5bb, hero called
turn 7c utg bet 15bb, button raise to 53bb, utg called
river Ad, utg check, button all in rest 34bb, utg called
guess what utg and button have? |
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f********2
发帖数: 368 | 26 大刘的这篇博客主要亮点在于3t3
大家等的都急了 需要安抚下 |
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d****6
发帖数: 971 | 27 txt或者非扫描的pdf？在这里问这个不违规吧？
俺3T1, 3T2都是老老实实买正版的勿拍 |
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h*****a
发帖数: 1295 | 28 照片版本的确看得头晕啊。。。不过还是赶快看了吧~不然都被剧透光了... |
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d****6
发帖数: 971 | 29 我一直憋着不看剧透，只看到标题还是死不掉的。。。 |
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d****6
发帖数: 971 | 31 我居然因为这个贴收到10个伪币 @_@
还从没见过伪币什么样真开心。。。
希望下周能收到offer
什么逻辑啊这是。。。。 |
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d****6
发帖数: 971 | 33 就是拖着不给我，总是一副很忙的样子打哈哈说有空的时候叫我去拿。我含蓄的问了两
次不好意思再问
了。。。
帮我带的人至少没看过3T1,2. 不知道是不是被谁半路截去先看了。。。
囧 |
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c**c
发帖数: 2593 | 34 我也托一回国的朋友帮我带三体3，结果人百忙之中特地抽时间
跑了两个书店都没找到这书，只好算了。 |
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un
发帖数: 1311 | 35 u can ask Lao Yao to mail u one directly mah :) |
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un
发帖数: 1311 | 37 but he remembers u very clearly :)
told me about how u translated Foundation
said pity u couldn't do more, haha |
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d****6
发帖数: 971 | 39 哇，基地是楼上翻译的？
科幻版真好，牛人多，发帖还发包子～ |
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un
发帖数: 1311 | 40 haha //pat young generation
calc is very bull... |
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h*****a
发帖数: 1295 | 41 膜拜下~
开个贴介绍下哈lol
版上还有别的大牛么？ |
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un
发帖数: 1311 | 46 哈哈，我记得在哪儿看到过你回忆翻译基地 的文章
不过现在找不到啦 |
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s***i
发帖数: 600 | 50 我的三体3也是同样命运。
不过带的人虽然没看过1，2。还是先看了3.
估计年三十能拿到。
不过我看了扫描版，不急了。买个正版的，就为支持一下。 |
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