x**2
发帖数: 255 | 1 最近一个克隆做的很郁闷，还望各位高手相助~
谢谢！
由于实验需要，要把两个DNA片断插入到昆虫细胞表达载体(pFastbac)的同一个多克隆
位点中，该表达载体内的多克隆位点有BssHII，EcoR1, Xba1和HindIII。
我要插入的片段是：
EcoR1-片段1-Nhe1（Xba1的同尾酶），和Xba1-片段2-HindIII，
我尝试过三个片段一起连接(three way ligation)，板子上长的两个点都不对（平行做
的BssHII-片段4-Nhe1，Xba1-片段2-HindIII成功得到正确质粒）。
我后来先把片段2插入到载体中，得到质粒：载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体。
然后再尝试把EcoR1-片段1-Nhe1插入，板子上长的两个点还是都不对，得到的质粒用双
酶切鉴定好像是自连质粒（虽然我双酶切的载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体）。
个人认为不是双酶切载体的问题，因为：1，EcoR1, Xba1两个酶切位点相隔50bp；如果只
有一个酶切动了质粒那么应该会有很多自连载体，而我的板子上只得到两个点。
我测序鉴定过载体 |
g*******q
发帖数: 15 | 2 For EcoR I and Xba I, "Double digest is not recommended. A sequential digest
is required, using each enzyme in its supplied NEBuffer."--from NEWB
website. |
x**2
发帖数: 255 | 3 Thank you very much.
But actually I used EcoR1 HF instead of EcoR1, which can be used in the
double digestion with Xba1 in buffer 4 with BSA |
g***y
发帖数: 201 | 4 看来看去，觉得问题很可能在片段1上。
你的片段1是怎么得到的呢？
有没可能你的片断末端跟你假设的不符？
比如假设是，EcoR1-片段1-Nhe1
其实是EcoR1-片段1-EcoR1－－如果你的片断1原来是在topo里面，就杯具了,除非是pcr primer末端加上nhe1位点。
【在 x**2 的大作中提到】
: 最近一个克隆做的很郁闷，还望各位高手相助~
: 谢谢！
: 由于实验需要，要把两个DNA片断插入到昆虫细胞表达载体(pFastbac)的同一个多克隆
: 位点中，该表达载体内的多克隆位点有BssHII，EcoR1, Xba1和HindIII。
: 我要插入的片段是：
: EcoR1-片段1-Nhe1（Xba1的同尾酶），和Xba1-片段2-HindIII，
: 我尝试过三个片段一起连接(three way ligation)，板子上长的两个点都不对（平行做
: 的BssHII-片段4-Nhe1，Xba1-片段2-HindIII成功得到正确质粒）。
: 我后来先把片段2插入到载体中，得到质粒：载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体。
: 然后再尝试把EcoR1-片段1-Nhe1插入，板子上长的两个点还是都不对，得到的质粒用双
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x**2
发帖数: 255 | 5 谢谢回复～
我的片段1确实是在TOPO里，
我的正向primer含EcoR1位点和6个保护碱基，反向pcr primer含Nhe1和6个保护碱基。扩出的片段末端加A后连到TOPO上。
这样会有问题么？
或者我把片段1前面的酶切位点改成BssHII？这样就和片段4的酶切位点一样了。
谢谢～ |
g***y
发帖数: 201 | 6 假设所有序列分析都正确的话，
你的这个策略仍然存在一个缺欠（不确定就是这个问题）
就是， you don't know whether Nhe1 digestion is complete or not.
因为片断两端都有EcoR1位点，所以容易造成完全酶切的假象。
想像一下，如果somehow Nhe1didn't work,你根本就不知道,
回收的片断就是EcoR1-片断1－EcoR1。
既然你的片断已经在topo 里了，建议你做 sequential digestion.
先做Nhe1 digestion，然后取一点样品run gel,看是否完全linearize
（更精确的办法是取一点样品，加另外一个跟Nhe1不同测的topo上的单切点酶，
然后跑胶，确定只有两条带）。
然后再加EcoR1。最后回收所要片断。
这样可以最大限度避免EcoR1-片断1－EcoR1的存在。
。扩出的片段末端加A后连到TOPO上。
【在 x**2 的大作中提到】
: 谢谢回复～
: 我的片段1确实是在TOPO里，
: 我的正向primer含EcoR1位点和6个保护碱基，反向pcr primer含Nhe1和6个保护碱基。扩出的片段末端加A后连到TOPO上。
: 这样会有问题么？
: 或者我把片段1前面的酶切位点改成BssHII？这样就和片段4的酶切位点一样了。
: 谢谢～
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