x**2 发帖数: 255 | 1 最近一个克隆做的很郁闷,还望各位高手相助~
谢谢!
由于实验需要,要把两个DNA片断插入到昆虫细胞表达载体(pFastbac)的同一个多克隆
位点中,该表达载体内的多克隆位点有BssHII,EcoR1, Xba1和HindIII。
我要插入的片段是:
EcoR1-片段1-Nhe1(Xba1的同尾酶),和Xba1-片段2-HindIII,
我尝试过三个片段一起连接(three way ligation),板子上长的两个点都不对(平行做
的BssHII-片段4-Nhe1,Xba1-片段2-HindIII成功得到正确质粒)。
我后来先把片段2插入到载体中,得到质粒:载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体。
然后再尝试把EcoR1-片段1-Nhe1插入,板子上长的两个点还是都不对,得到的质粒用双
酶切鉴定好像是自连质粒(虽然我双酶切的载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体)。
个人认为不是双酶切载体的问题,因为:1,EcoR1, Xba1两个酶切位点相隔50bp;如果只
有一个酶切动了质粒那么应该会有很多自连载体,而我的板子上只得到两个点。
我测序鉴定过载体 |
g*******q 发帖数: 15 | 2 For EcoR I and Xba I, "Double digest is not recommended. A sequential digest
is required, using each enzyme in its supplied NEBuffer."--from NEWB
website. |
x**2 发帖数: 255 | 3 Thank you very much.
But actually I used EcoR1 HF instead of EcoR1, which can be used in the
double digestion with Xba1 in buffer 4 with BSA |
g***y 发帖数: 201 | 4 看来看去,觉得问题很可能在片段1上。
你的片段1是怎么得到的呢?
有没可能你的片断末端跟你假设的不符?
比如假设是,EcoR1-片段1-Nhe1
其实是EcoR1-片段1-EcoR1--如果你的片断1原来是在topo里面,就杯具了,除非是pcr primer末端加上nhe1位点。
【在 x**2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近一个克隆做的很郁闷,还望各位高手相助~ : 谢谢! : 由于实验需要,要把两个DNA片断插入到昆虫细胞表达载体(pFastbac)的同一个多克隆 : 位点中,该表达载体内的多克隆位点有BssHII,EcoR1, Xba1和HindIII。 : 我要插入的片段是: : EcoR1-片段1-Nhe1(Xba1的同尾酶),和Xba1-片段2-HindIII, : 我尝试过三个片段一起连接(three way ligation),板子上长的两个点都不对(平行做 : 的BssHII-片段4-Nhe1,Xba1-片段2-HindIII成功得到正确质粒)。 : 我后来先把片段2插入到载体中,得到质粒:载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体。 : 然后再尝试把EcoR1-片段1-Nhe1插入,板子上长的两个点还是都不对,得到的质粒用双
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x**2 发帖数: 255 | 5 谢谢回复~
我的片段1确实是在TOPO里,
我的正向primer含EcoR1位点和6个保护碱基,反向pcr primer含Nhe1和6个保护碱基。扩出的片段末端加A后连到TOPO上。
这样会有问题么?
或者我把片段1前面的酶切位点改成BssHII?这样就和片段4的酶切位点一样了。
谢谢~ |
g***y 发帖数: 201 | 6 假设所有序列分析都正确的话,
你的这个策略仍然存在一个缺欠(不确定就是这个问题)
就是, you don't know whether Nhe1 digestion is complete or not.
因为片断两端都有EcoR1位点,所以容易造成完全酶切的假象。
想像一下,如果somehow Nhe1didn't work,你根本就不知道,
回收的片断就是EcoR1-片断1-EcoR1。
既然你的片断已经在topo 里了,建议你做 sequential digestion.
先做Nhe1 digestion,然后取一点样品run gel,看是否完全linearize
(更精确的办法是取一点样品,加另外一个跟Nhe1不同测的topo上的单切点酶,
然后跑胶,确定只有两条带)。
然后再加EcoR1。最后回收所要片断。
这样可以最大限度避免EcoR1-片断1-EcoR1的存在。
。扩出的片段末端加A后连到TOPO上。
【在 x**2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢回复~ : 我的片段1确实是在TOPO里, : 我的正向primer含EcoR1位点和6个保护碱基,反向pcr primer含Nhe1和6个保护碱基。扩出的片段末端加A后连到TOPO上。 : 这样会有问题么? : 或者我把片段1前面的酶切位点改成BssHII?这样就和片段4的酶切位点一样了。 : 谢谢~
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