c*********r
发帖数: 1046 | 1 两端加上酶切位点,最多长20bp, PCR 产物在50bp左右,这么小的片段好连接吗?
还有其他方法吗? 谢谢! |
b******k
发帖数: 1874 | 2 好像直接合成oligo，然后anneal，再链接就行。不过我也没有具体干过。我看的文章也
没有具体说怎么样anneal的。。。。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 两端加上酶切位点,最多长20bp, PCR 产物在50bp左右,这么小的片段好连接吗?
: 还有其他方法吗? 谢谢!
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l*********s
发帖数: 5409 | |
n******d
发帖数: 680 | 4 合成末端磷酸化的互补oligo，然后在TE中变性复性，用T4 ligase连接，oligo记得过
量加
长出来的clone基本都是，不过最好在合成的oligo中设好合适的酶切位点
章也
【在 b******k 的大作中提到】
: 好像直接合成oligo，然后anneal，再链接就行。不过我也没有具体干过。我看的文章也
: 没有具体说怎么样anneal的。。。。
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b******k
发帖数: 1874 | 5 这个正是太巧了。我也想问这个问题的。可否再详细一点？
oligo默认都是末端Pi的吧？
怎么在TE中变性复兴？oligo的浓度、反应的时间？和载体的比例，连接时？
过量加长？
谢谢
【在 n******d 的大作中提到】
: 合成末端磷酸化的互补oligo，然后在TE中变性复性，用T4 ligase连接，oligo记得过
: 量加
: 长出来的clone基本都是，不过最好在合成的oligo中设好合适的酶切位点
:
: 章也
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l*********s
发帖数: 5409 | 6 Nay, the 5-prime end of synthesized oligos is normally hydroxy group, you
need to order additional modification.
For annealing, water is also OK.Just throw oligo solutions in boiled water
and let it cool naturally.
【在 b******k 的大作中提到】
: 这个正是太巧了。我也想问这个问题的。可否再详细一点？
: oligo默认都是末端Pi的吧？
: 怎么在TE中变性复兴？oligo的浓度、反应的时间？和载体的比例，连接时？
: 过量加长？
: 谢谢
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a***e
发帖数: 1010 | 7 when u order oligo, the end is -OH, you have to kinase first by T4 PNK.
you can kinase (+) & (-) strands together in 50 ul volumn. then boil it
in water, let the water cool down on bench gradulately.
then it is enought for ligation.
【在 b******k 的大作中提到】
: 这个正是太巧了。我也想问这个问题的。可否再详细一点？
: oligo默认都是末端Pi的吧？
: 怎么在TE中变性复兴？oligo的浓度、反应的时间？和载体的比例，连接时？
: 过量加长？
: 谢谢
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b******k
发帖数: 1874 | 8 so, if i am going to ligate two tandem short fragments (say, 50bp each):
synthesize 50nt oligo of Sense and antisense (with 5' phosphate group modifi
cation),
anneal them by boiling and cooling naturally,
then ligate the annealed fragments (ideally, with synthesizd 3' overhang fro
m first one, and 5' overhang from 2nd)by conventional T4 ligase system?
thanks.
【在 l*********s 的大作中提到】
: Nay, the 5-prime end of synthesized oligos is normally hydroxy group, you
: need to order additional modification.
: For annealing, water is also OK.Just throw oligo solutions in boiled water
: and let it cool naturally.
:
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b******k
发帖数: 1874 | 9 T4 pnk:
Catalyzes the transfer and exchange of Pi from the γ position of ATP to
the 5 -hydroxyl terminus of polynucleotides (double-and single-stranded
DNA and RNA) and nucleoside 3-monophosphates. Polynucleotide Kinase also
catalyzes the removal of 3-phosphoryl groups from 3-phosphoryl
polynucleotides, deoxynucleoside 3-monophosphates and deoxynucleoside 3
-diphosphates (1).
Thanks a lot.
sounds like I need to go over some basic, get confused....
【在 a***e 的大作中提到】
: when u order oligo, the end is -OH, you have to kinase first by T4 PNK.
: you can kinase (+) & (-) strands together in 50 ul volumn. then boil it
: in water, let the water cool down on bench gradulately.
: then it is enought for ligation.
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c*********r
发帖数: 1046 | 10 Thanks a lot!
Do I need to purificate the product of anneal before ligation? |
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g*********5
发帖数: 2533 | 11 design a long primer and use quikchange kit do insert mutation. |
i***a
发帖数: 11095 | 12 n多年前做过，应该挺简单的
若是30bp的话
___________________
_____________________
如上图一样设计引物，中间15-20个碱基配对，两端再加上6个碱基的内切酶位点，再各
加3-4个保护碱基
正常PCR后，电泳，纯化，测浓度，各自酶切，失活，酒精沉淀，再溶，然后用T4连接酶连接
clony PCR的时候可以用primer之一跟vector上附近的一个primer试试看 |
i***a
发帖数: 11095 | 13 PCR的时候不需要底物，加设计好的两条引物就Ok了 |
h*****9
发帖数: 4028 | 14 干过此事。很容易。从95度起设几个梯度用PCR仪逐渐降温即可。
章也
【在 b******k 的大作中提到】
: 好像直接合成oligo，然后anneal，再链接就行。不过我也没有具体干过。我看的文章也
: 没有具体说怎么样anneal的。。。。
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x*****e
发帖数: 309 | 15 贴个我的做法吧，成功率很高，供参考。
1、引物退火溶液Annealing buffer: NaCl 100 mM, Hepes 50 mM, pH 7.4
(1ml: NaCl 2M 50ul, HEPES 1M 50ul, 加水至1 ml，pH试纸调pH)
2、引物浓度约=28.3ug/OD, 加入94ul Annealing Buffer 至终浓度 0.3 mg/ml
3、加入上下游引物各10 ul，Annealing Buffer 30 ul，90度4分钟，70度10分钟，然
后放到500 ml装有70度热水的烧杯中，室温冷却后连接或-20度保存。
4、连接质粒，加入2ul退火后的产物，1 ul T4 DNA ligase buffer, 1ul pSR/BglII+
HindIII 线性质粒, 5 ul 水，1 ul T4 Ligase. 连接（16度过夜或室温30－120分钟）。
5、加入1 ul Bgl II 至连接产物中，37度消化30分钟，转化感受态细胞。
6、挑取转换子，提质粒，酶切鉴定，注意阴性克隆切出条带大概1kb（227，248和
281bp条带差异不明显，故对
【在 h*****9 的大作中提到】
: 干过此事。很容易。从95度起设几个梯度用PCR仪逐渐降温即可。
:
: 章也
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s********n
发帖数: 2939 | 16 设计oligo的时候可以把粘性末端设计好，链接前可以不用做酶切。
我试过的一个protocol，非常简单好用：
1. oligos用TE or H2O溶解，浓度100 uM；
2. 磷酸化准备如下，37C一个小时, 70C for 10 min.
15 ul H2O + 2 ul oligo (100 uM) + 2 ul T4 ligase buffer + 1 ul TNK
3. 退火反应如下，95C 5 min in PCR cycler，RT for 30 min.
18 ul H2O + 1 ul oligo F + 1 ul oligo R (final 0.5 uM fragment)
这个产物可以直接用于连接。 |
c*********r
发帖数: 1046 | 17 谢谢smartkevin 奉献简单的protocol!
【在 s********n 的大作中提到】
: 设计oligo的时候可以把粘性末端设计好，链接前可以不用做酶切。
: 我试过的一个protocol，非常简单好用：
: 1. oligos用TE or H2O溶解，浓度100 uM；
: 2. 磷酸化准备如下，37C一个小时, 70C for 10 min.
: 15 ul H2O + 2 ul oligo (100 uM) + 2 ul T4 ligase buffer + 1 ul TNK
: 3. 退火反应如下，95C 5 min in PCR cycler，RT for 30 min.
: 18 ul H2O + 1 ul oligo F + 1 ul oligo R (final 0.5 uM fragment)
: 这个产物可以直接用于连接。
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c*********r
发帖数: 1046 | 18 很具体! 谢谢!
）。
【在 x*****e 的大作中提到】
: 贴个我的做法吧，成功率很高，供参考。
: 1、引物退火溶液Annealing buffer: NaCl 100 mM, Hepes 50 mM, pH 7.4
: (1ml: NaCl 2M 50ul, HEPES 1M 50ul, 加水至1 ml，pH试纸调pH)
: 2、引物浓度约=28.3ug/OD, 加入94ul Annealing Buffer 至终浓度 0.3 mg/ml
: 3、加入上下游引物各10 ul，Annealing Buffer 30 ul，90度4分钟，70度10分钟，然
: 后放到500 ml装有70度热水的烧杯中，室温冷却后连接或-20度保存。
: 4、连接质粒，加入2ul退火后的产物，1 ul T4 DNA ligase buffer, 1ul pSR/BglII+
: HindIII 线性质粒, 5 ul 水，1 ul T4 Ligase. 连接（16度过夜或室温30－120分钟）。
: 5、加入1 ul Bgl II 至连接产物中，37度消化30分钟，转化感受态细胞。
: 6、挑取转换子，提质粒，酶切鉴定，注意阴性克隆切出条带大概1kb（227，248和
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g*********5
发帖数: 2533 | 19 I think mutation is the easiest way to do. just with quikchange kit, about
200 bucks.
because your pcr fragment is smaller than 30 bp, so you could design primer
with this sequence and flanked with vector sequence, 15 bp each, then use
this 60 bp primer pair do insert mutation, just one PCR and transform.
good luck |
X***n
发帖数: 366 | 20 我的做法是：
1. Linearize plasmid with restriction enzymes.
2. 1 uM sense and antisense strand in Qiagen EB buffer, 95oC 5min, turn off PCR machine directly.After half an hour chill it on ice.
3. 10-100 ng linearized plasmid plus 1 uL 1 uM annealed insert, 5 uL fast ligation system, RT. 10 min.
4. Transform DH5alpha competent cell.
I don't think you need to phosphorylation of the insert.It works for me.
【在 c*********r 的大作中提到】
: 很具体! 谢谢!
:
: ）。
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b******k
发帖数: 1874 | 21 3'prime of oligo is default hydroxy group,right? not 5'prime.
why do we need to add 3 prime Pi to the oligo before annealling?
thanks.
【在 l*********s 的大作中提到】
: Nay, the 5-prime end of synthesized oligos is normally hydroxy group, you
: need to order additional modification.
: For annealing, water is also OK.Just throw oligo solutions in boiled water
: and let it cool naturally.
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