m***o
发帖数: 272 | 1 我用HA做为no antibody control because IgG background is too strong。如果以HA
来normalization，我做的TF binding 有显著差别。而我的TF binding如果用 % input
则差别很小。现在的问题是，不同sample 的HA 总是有差别。怎么来消除HA binding
的差异？是不是样品的处理造成？用的细胞是分化组和未分化组。两组蛋白含量差别特
别大。不知相同细胞数超声，但是蛋白含量可以差10倍，是不是超声条件也该不同？但
是电泳看，大小差不多。请高人指点迷津。谢谢！ |
m***o
发帖数: 272 | 2 再问一声，又谁知道吗？HA/IgG在不同样品间的差别该怎么处理？ |
a***e
发帖数: 1010 | 3 what is HA control? something unrelated or related?
HA
input
binding
【在 m***o 的大作中提到】
: 我用HA做为no antibody control because IgG background is too strong。如果以HA
: 来normalization，我做的TF binding 有显著差别。而我的TF binding如果用 % input
: 则差别很小。现在的问题是，不同sample 的HA 总是有差别。怎么来消除HA binding
: 的差异？是不是样品的处理造成？用的细胞是分化组和未分化组。两组蛋白含量差别特
: 别大。不知相同细胞数超声，但是蛋白含量可以差10倍，是不是超声条件也该不同？但
: 是电泳看，大小差不多。请高人指点迷津。谢谢！
|
m***o
发帖数: 272 | 4 HA is unrelated control similar like IgG. Thank you! |
m***o
发帖数: 272 | 5 Just now read a post on over-sonication on % input. http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/41842.html
If over-sonication decreases % input, will it increase the IgG/HA binding? |
a***e
发帖数: 1010 | 6 in these cases, both HA and IgG are background controls. Theoretically,
both of them should have no pulldown signals at all (= 0). If you divide
something by HA or IgG signal, any little variation will change your ratio
dramatically. So, neither of them is the right normalization.
A good normalization method is using 1% input as a control.
However, the best normalization is using some internal controls that are not
changed by your treatment. For example, your TF binds gene GAPDH and gene
X. |
a****o
发帖数: 1786 | 7 如果超声不充分的话，可溶蛋白含量少，不同细胞需要的超声条件可能不同
HA
input
binding
【在 m***o 的大作中提到】
: 我用HA做为no antibody control because IgG background is too strong。如果以HA
: 来normalization，我做的TF binding 有显著差别。而我的TF binding如果用 % input
: 则差别很小。现在的问题是，不同sample 的HA 总是有差别。怎么来消除HA binding
: 的差异？是不是样品的处理造成？用的细胞是分化组和未分化组。两组蛋白含量差别特
: 别大。不知相同细胞数超声，但是蛋白含量可以差10倍，是不是超声条件也该不同？但
: 是电泳看，大小差不多。请高人指点迷津。谢谢！
|
