m*********n
发帖数: 215 | 1 请问版上有人熟悉ChIP-seq么？用细胞系表达HA-tag的蛋白然后isolate chromatin做
ChIP-seq。不知道大概需要多少细胞才能得到比较好的浓度的chromatin？按说HA的
antibody是相当好了。如果有熟悉ChIP的前辈可以帮忙指点下，非常感谢！！ |
y*********1
发帖数: 46 | 2 Never used HA-tag for ChIP before. We usually use 20 million cells (2X10*7)
to get enough DNA for ChIP-seq. |
h**********y
发帖数: 18 | 3 I use 5X10*7~1X10*8 cells for ChIP for endogenous protein.
【在 m*********n 的大作中提到】
: 请问版上有人熟悉ChIP-seq么？用细胞系表达HA-tag的蛋白然后isolate chromatin做
: ChIP-seq。不知道大概需要多少细胞才能得到比较好的浓度的chromatin？按说HA的
: antibody是相当好了。如果有熟悉ChIP的前辈可以帮忙指点下，非常感谢！！
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C***Y
发帖数: 61 | 4 Usually 4 million cells are enough for most transcription factor ChIP-seq. |
m*********n
发帖数: 215 | 5 谢谢楼上各位分享经验！
我们实验室刚刚开始做ChIP-seq，有一个学生做这个，说是揣摩了很久的protocol。
我plate了25million N2A cells给他，他还说Chromatin浓度不够。我吐血。。。因为
transfection看起来很好，细胞很健康。就算撑死细胞死了5million吧，那还有
20million活着呢。因为我自己不做这个，所以也不是很懂。但是我总觉得>20 million
cells怎么可能不够。如果做ChIP的话是more than enough。虽然说ChIP-seq大概需要
更多的chromatin，但是因为表达的蛋白是HA-Tag的，HA的抗体非常非常好，所以
Chromatin的浓度要求应该比一般蛋白的要低。
我就是很不明白为什么总是说Chromatin不够。前面说用Primary culture做,我Culture
了4个litter（35个胚胎）的小鼠皮层，那个学生也说是细胞不够。。。所以我觉得不
对劲。但是老板也说不出个所以然来。实验拖拉着我急死了。
不知道前辈用的是什么Protocal呢？可以分享下吗？
【在 C***Y 的大作中提到】
: Usually 4 million cells are enough for most transcription factor ChIP-seq.
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m*********n
发帖数: 215 | 6 谢谢前辈分享经验。因为我做的那个蛋白没有很好的抗体做ChIP，所以才做了HA-tag的
融合蛋白，然后用HA抗体做ChIP-seq.请问前辈可以分享一下protocol吗？我自己不做
这个，是实验室的一个学生帮我做。他总是说chromatin不够，我plate了25million的
cell给他，他还是说不够，我都要疯掉了。。。
7)
【在 y*********1 的大作中提到】
: Never used HA-tag for ChIP before. We usually use 20 million cells (2X10*7)
: to get enough DNA for ChIP-seq.
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h****n
发帖数: 2552 | 7 Transient transfection后你的蛋白主要在胞质还是在核里面？有些蛋白over express
后会change localization |
m*********n
发帖数: 215 | 8 在细胞核内。overexpression后做过染色（蛋白自己的Antibody虽然不能用来ChIP-seq
，但是染色还是非常好的），都在核内。而且提取Chromatin的时候应该是全部
Chromatin吧，还没有加抗体呢。
express
【在 h****n 的大作中提到】
: Transient transfection后你的蛋白主要在胞质还是在核里面？有些蛋白over express
: 后会change localization
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h****n
发帖数: 2552 | 9 你的anti-ha抗体好是根据什么得出来的？好抗体做CHIP-seq的话20个million个细胞应
该足够了。ChIP-Seq里面很多步骤都很tricky。
你应该先检测抗体的pull-down的能力和效率。然后再看你sonication这一步产生片段
的大小是否合适。一般认为300-500之间最好。还有就是抗体和lysis反应的时间，有些
蛋白很容易降解，overnight是肯定不行的。 |
