o******n
发帖数: 511 | 1 我们想突变一个基因的一部分,最好是能像cut and paste那样,把这部分切下来,换一块
放进去,请问有什么办法做到吗? |
G******O
发帖数: 189 | 2 Are you going to make a knockin mouse?
【在 o******n 的大作中提到】
: 我们想突变一个基因的一部分,最好是能像cut and paste那样,把这部分切下来,换一块
: 放进去,请问有什么办法做到吗?
|
o******n
发帖数: 511 | 3 我们想把一个细菌的某个基因突变一部分，然后把别的细菌的相对应的基因片段插进去
看有什么变化没 |
s********n
发帖数: 2939 | 4 如果要置换的片段比较小，如100 bp以内，可以直接用QuikChange kit; 如果比较大，
Overlap PCR. |
F******p
发帖数: 2099 | 5 first do it on plasmid, then recombinant it into genome.
【在 o******n 的大作中提到】
: 我们想突变一个基因的一部分,最好是能像cut and paste那样,把这部分切下来,换一块
: 放进去,请问有什么办法做到吗?
|
n******d
发帖数: 680 | 6 ligation to T vector first.
反向设计引物扩增，cut掉一部分后直接加入梅切位点，然后连入你的目的片段。
over
【在 o******n 的大作中提到】
: 我们想突变一个基因的一部分,最好是能像cut and paste那样,把这部分切下来,换一块
: 放进去,请问有什么办法做到吗?
|
o******n
发帖数: 511 | 7 谢谢楼上几位，你们的回复很有启发性。
我看了下qiagen quikchange的信息，里面提到可以domain swapping，好像就是我们想
做的。有人做过吗，需要注意什么？ |
s********n
发帖数: 2939 | 8 QuikChange,Agilent的kit，作定点突变的经典，如果是小片段的置换没问题，但片段
太大效率就会很低。 |
h***e
发帖数: 146 | 9 咋没人用同源重组的counter selection marker？ |
o******n
发帖数: 511 | 10 sorry no Chinese input.
Thank you, smartkevin.
our gene fragment is ~150 bp.
Their application note said that people have found ways to insert/delete
pieces up to 3 kb?
【在 s********n 的大作中提到】
: QuikChange,Agilent的kit，作定点突变的经典，如果是小片段的置换没问题，但片段
: 太大效率就会很低。
|
|
|
o******n
发帖数: 511 | 11 allele exchange? Could you elaborate? :)
【在 h***e 的大作中提到】
: 咋没人用同源重组的counter selection marker？
|
s********n
发帖数: 2939 | 12 估计都可以，但就不知道效率如何了。不过估计150 bp应该没问题的，多挑几个克隆做
colony PCR screening就可以了。
【在 o******n 的大作中提到】
: sorry no Chinese input.
: Thank you, smartkevin.
: our gene fragment is ~150 bp.
: Their application note said that people have found ways to insert/delete
: pieces up to 3 kb?
|
h***e
发帖数: 146 | 13 http://www.nature.com/nprot/journal/v4/n2/pdf/nprot.2008.227.pdf
Figure 4 | Insertion of a nonselectable DNA fragment by recombineering.
(a) ‘Seamless’ method to insert nonselectable DNA fragment makes use of
selectable markers that can be used for positive as well as negative
selection
(e.g., galK).
Using this method you can change any sequence(From 1 to n bp) in the plasmid
and then homologous recombination into the chromosome.
【在 o******n 的大作中提到】
: allele exchange? Could you elaborate? :)
|
o******n
发帖数: 511 | 14 Thank you, huiee. I just saw your reply and will take a look. :) |
K*F
发帖数: 120 | 15 如果我理解的没有错的话，lz应该是想做基因组上的基因突变，我想应该做同源重组吧
。那就自己构建一个热敏质粒，然后转化到细菌里面去做交换，最快一个月做出来吧。 |
