x*****a
发帖数: 972 | 1 我从血液中提取了一些progenitor cells，在flasks上养了几天后，冻成好几个vial。
这两周，
化了3个，分别做了flow，看其中CD105+的比例，结果3个vial的比例分别是55%，30%，
12%左右，
差别很大。
这种情况，算正常的么？
每次的操作都一样。 |
h********0
发帖数: 944 | 2 你冻的时候混匀没有，另外染色的时候抗体混匀没，条件是否一样。Otherwise,机器是
不是很稳定。你是同时染三个，还是分三次做的。 |
x*****a
发帖数: 972 | 3 混匀、染色这些应该没什么问题，protocol和操作都一样的。
机器不是我弄的，是core facility的人给做的，我每次都去那里做，他对我的样品也
比较有经验了。
我分三次做的。
我用买来的细胞做了control，这种细胞的读书比较稳定，但也偶尔出现比较大的偏差 |
t******n
发帖数: 33 | 4 Do you gate out dead cells with PI?
【在 x*****a 的大作中提到】
: 混匀、染色这些应该没什么问题，protocol和操作都一样的。
: 机器不是我弄的，是core facility的人给做的，我每次都去那里做，他对我的样品也
: 比较有经验了。
: 我分三次做的。
: 我用买来的细胞做了control，这种细胞的读书比较稳定，但也偶尔出现比较大的偏差
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x*****a
发帖数: 972 | 5 其实我不太会操作flow的仪器，都是那个technician在做，他经验蛮多的，之前让他做
单染的，都挺好。这次是三染，就有问题了。我用的PE，Cy5, FITC。问题主要是PE的
部分。
之前我单染PE，试了很多浓度，找了个最合适的，效果挺好的。然后再三染的时候，PE
就开始乱七八糟了 |
t******n
发帖数: 33 | 6 use PI to gate out dead cells
use isotype control
use single color control
use Fc receptor blocker
check FITC and PE compensation
PE
【在 x*****a 的大作中提到】
: 其实我不太会操作flow的仪器，都是那个technician在做，他经验蛮多的，之前让他做
: 单染的，都挺好。这次是三染，就有问题了。我用的PE，Cy5, FITC。问题主要是PE的
: 部分。
: 之前我单染PE，试了很多浓度，找了个最合适的，效果挺好的。然后再三染的时候，PE
: 就开始乱七八糟了
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p****l
发帖数: 291 | 7 It seems that compensation of PE and FITC is the problem.
If in single color staining PE works well, in three colors staining ab
itself and the dilution should still be ok.
I think vial-to-vial variation probably is another problem.
PE
【在 x*****a 的大作中提到】
: 其实我不太会操作flow的仪器，都是那个technician在做，他经验蛮多的，之前让他做
: 单染的，都挺好。这次是三染，就有问题了。我用的PE，Cy5, FITC。问题主要是PE的
: 部分。
: 之前我单染PE，试了很多浓度，找了个最合适的，效果挺好的。然后再三染的时候，PE
: 就开始乱七八糟了
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