A*******e
发帖数: 284 | 1 也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好，从没有达到所说的90% |
b******n
发帖数: 4225 | 2 可能你的DNA量太高了，稀释成几管切然后回收抽真空浓缩
这样效果不会差的
【在 A*******e 的大作中提到】
: 也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
: 拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
: 粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
: 什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
: 两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
: 质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
: 请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
: 净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
: 附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
: 率不好，从没有达到所说的90%
|
p*****c
发帖数: 1506 | 3 不要用空质粒，
找一个这两个位点间有insert的质粒，酶切完以后跑胶，把大小不对没切完全的分掉
【在 A*******e 的大作中提到】
: 也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
: 拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
: 粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
: 什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
: 两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
: 质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
: 请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
: 净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
: 附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
: 率不好，从没有达到所说的90%
|
A*******e
发帖数: 284 | 4 我大约在200ul体系里面加了几十ug的质粒，按理不算多了。
我也这么想的，在中间克隆一个2-3kb的片断进去，再利用分子量的差异回收。理论上
可行，但实际操作上还有困难，因为没有切开的质粒电泳是不按线性质粒规律的，跑得
要快一点，说不定也就赶上切开的质粒了 |
c****1
发帖数: 1095 | 5 酶切空质粒确实比较麻烦。我的经验是，一次酶切后，纯化，再酶切，再纯化，再酶切
。三轮过后，基本就没有没切开的了。
其实，插入片段也是个方法，你怕环状DNA跑的快，就插入个大点的片段，这个应该难
度不大。
BTW，为什么要这么大量？让我们开开眼？ |
g*****y
发帖数: 6325 | 6 为什么要这么高的浓度转化呢？ 我每次就切1ug. 胶回收，然后ligation, 转化都能挑
到正确得质粒。还有酶切一般我都不会
切超过2ug／tube. qiagen胶回收。
【在 A*******e 的大作中提到】
: 也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
: 拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
: 粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
: 什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
: 两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
: 质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
: 请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
: 净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
: 附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
: 率不好，从没有达到所说的90%
|
g*****y
发帖数: 6325 | 7 200ul体积实在太大了。 酶切总体积不应该超过50ul. 如果需要切很多，应该分几个
tube, 比如5个tube, 40ul/tube. 跑胶
后在合并起来。我觉得你放太多dna。
【在 A*******e 的大作中提到】
: 我大约在200ul体系里面加了几十ug的质粒，按理不算多了。
: 我也这么想的，在中间克隆一个2-3kb的片断进去，再利用分子量的差异回收。理论上
: 可行，但实际操作上还有困难，因为没有切开的质粒电泳是不按线性质粒规律的，跑得
: 要快一点，说不定也就赶上切开的质粒了
|
s******y
发帖数: 28562 | 8 I think the empty plasmid from your negative control cells are actually due
to self-ligation.
You may need to treat your cutted plasmid with Alkaline Phosphatase for 5~10
minutes right after digestion and then recover the cutted produt on agarose
.
【在 A*******e 的大作中提到】
: 也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
: 拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
: 粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
: 什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
: 两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
: 质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
: 请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
: 净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
: 附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
: 率不好，从没有达到所说的90%
|
r**i
发帖数: 514 | 9 dna纯度对酶切效率有影响。
最好每次不要切很多，可以分多份切。
也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好，从没有达到所说的90%
【在 A*******e 的大作中提到】
: 也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
: 拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
: 粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
: 什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
: 两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
: 质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
: 请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
: 净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
: 附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
: 率不好，从没有达到所说的90%
|
g*****y
发帖数: 6325 | 10 如果用2个酶来切，两个sticky ends是不同得，自己ligate得几率很低。 根本不需要
用phosphatase.
due
10
agarose
【在 s******y 的大作中提到】
: I think the empty plasmid from your negative control cells are actually due
: to self-ligation.
: You may need to treat your cutted plasmid with Alkaline Phosphatase for 5~10
: minutes right after digestion and then recover the cutted produt on agarose
: .
|
|
|
h*****9
发帖数: 4028 | 11 太高了。通常都是1-2ug/50ul。另外你的酶量加太多Glycerol可能会对酶切不利。
回收只要是跑胶纯化，未梅切质粒污染应该非常少。
【在 A*******e 的大作中提到】
: 我大约在200ul体系里面加了几十ug的质粒，按理不算多了。
: 我也这么想的，在中间克隆一个2-3kb的片断进去，再利用分子量的差异回收。理论上
: 可行，但实际操作上还有困难，因为没有切开的质粒电泳是不按线性质粒规律的，跑得
: 要快一点，说不定也就赶上切开的质粒了
|
g*****y
发帖数: 6325 | 12 general rule is : 加入得酶不超过酶切总体积得1/10.
【在 h*****9 的大作中提到】
: 太高了。通常都是1-2ug/50ul。另外你的酶量加太多Glycerol可能会对酶切不利。
: 回收只要是跑胶纯化，未梅切质粒污染应该非常少。
|
s******y
发帖数: 28562 | 13 根据我自己的经验，这个并不确实。
有一个事情是，如果两个restriction site 距离得不是很远的话，有一个切了就会
影响到另外一个的切割效率，所以产物中会有一定比例的质粒是只被切了一刀的。
这种质粒会很容易被连接起来，所以不需要占产物的很高比例（即使只占1%）也能产生
很高的transformation effeciency.
【在 g*****y 的大作中提到】
: 如果用2个酶来切，两个sticky ends是不同得，自己ligate得几率很低。 根本不需要
: 用phosphatase.
:
: due
: 10
: agarose
|
A*******e
发帖数: 284 | 14 谢谢诸位！我这个是因为需要建library，最好达到10(9)，最低也得10（7）才
能说得过去，所以要求很高的浓度和效率。也有可能是自连，就是在两个酶只有一个酶
成功切了，而另外一个没有切的情况下，肯定自连。因为需要连接的效率，所以ALK之
类的处理被排除。也不想分布酶切，因为首先有共用buffer，其次我不想多纯化一次损
失我的vector.按诸位的意见，我打算降低单个酶切反应dna的量试试看。另外我这两个
酶切位点相距12bp，我想不会相互干扰。 这12bp中还有另外一个酶切位点，也是同样
的工作buffer，我想先用双酶切后，再加点这个酶，争取把那些漏网之鱼逮到干掉。
诸位有好主意，请不吝赐教！谢谢 |
m*********7
发帖数: 5207 | 15 In principle, two different sticky ends should not self ligate.
in reality, it happens all the time!
I still don't understand why after so many years, and I keep using
phosphatase under that circumstances.
【在 g*****y 的大作中提到】
: 如果用2个酶来切，两个sticky ends是不同得，自己ligate得几率很低。 根本不需要
: 用phosphatase.
:
: due
: 10
: agarose
|
g*****y
发帖数: 6325 | 16 我双酶从来不用phosphotase, 从来没出过问题。
【在 m*********7 的大作中提到】
: In principle, two different sticky ends should not self ligate.
: in reality, it happens all the time!
: I still don't understand why after so many years, and I keep using
: phosphatase under that circumstances.
|
C*******e
发帖数: 4348 | 17 反正你要胶回收的
酶切结束以后，只要是NEB的buffer 2,3 或者4，直接加点CIP进去37度1小时就可以了
然后一样胶回收
我不喜欢QIAGEN的胶回收kit
效率不高
绝对没有90%
lz可以试试ZymoResearch的胶回收kit
直接上他们家网站，要free sample
不喜欢也不用花钱买了
【在 A*******e 的大作中提到】
: 谢谢诸位！我这个是因为需要建library，最好达到10(9)，最低也得10（7）才
: 能说得过去，所以要求很高的浓度和效率。也有可能是自连，就是在两个酶只有一个酶
: 成功切了，而另外一个没有切的情况下，肯定自连。因为需要连接的效率，所以ALK之
: 类的处理被排除。也不想分布酶切，因为首先有共用buffer，其次我不想多纯化一次损
: 失我的vector.按诸位的意见，我打算降低单个酶切反应dna的量试试看。另外我这两个
: 酶切位点相距12bp，我想不会相互干扰。 这12bp中还有另外一个酶切位点，也是同样
: 的工作buffer，我想先用双酶切后，再加点这个酶，争取把那些漏网之鱼逮到干掉。
: 诸位有好主意，请不吝赐教！谢谢
|
s********n
发帖数: 2939 | 18 以前只是做克隆，怎么折腾总能出要的东东。但现在做库的话就需要十分小心，我的制
备的vector几乎没有background，但链接效率不高，最终只能拿到1E7/ug vector。希
望能介绍一些提高链接效率的方法。 |
n***e
发帖数: 180 | 19 回收试一下fermentas的glass beads based DNA purification，大概回收率在8成左右
，qiagen的应该在5成以下 |
d*********n
发帖数: 10 | 20 强烈建议用 MO BIO Laboratories, Inc的UltraClean DNA purification Kit (Cat #
= 12100-300). 自从我摒弃QIAGEN的Kit,改用MO BIO的Kit以后，胶回收片段的回收率
一直很高很稳定(很强大)。我们实验室现在都在用这个KIT.
GOOD LUCK! |
|
|
x*****e
发帖数: 309 | 21 看来做酶切的人还不少。其实双酶切分两步应该可行，先用对酶切要求比较高（查NEB
附录上需要保护碱基较多的酶）的酶切，反应完后加直接加第二个酶切：不用回收DNA
。这里有人问buffer不同怎么办的问题，查查哪里不同，一般也就是NaCl浓度差异，缺
啥补啥，自己加点调成第二个酶用的buffer就可以了。我现在空质粒双酶切完直接乙醇
沉淀回收（小片段沉淀不下来？）：加2倍体积无水乙醇，可选加1/10体积3M醋酸钠，-
20度大于20分钟，14000rpm*15min回收DNA,70% 乙醇洗2遍，风干后10-20ul水溶解（1-
2 ug DNA），如果有大的插入片段就走胶回收吧。 |
s********n
发帖数: 2939 | 22 你建议的这个kit不是spin column的，这个公司的spin column的产品如何？
#
【在 d*********n 的大作中提到】
: 强烈建议用 MO BIO Laboratories, Inc的UltraClean DNA purification Kit (Cat #
: = 12100-300). 自从我摒弃QIAGEN的Kit,改用MO BIO的Kit以后，胶回收片段的回收率
: 一直很高很稳定(很强大)。我们实验室现在都在用这个KIT.
: GOOD LUCK!
|
C*******e
发帖数: 4348 | 23 我推荐的ZymoResearch的是spin column
【在 s********n 的大作中提到】
: 你建议的这个kit不是spin column的，这个公司的spin column的产品如何？
:
: #
|
A*******e
发帖数: 284 | 24 请问我两个酶有共用buffer，为什么还要分布切呢？ 空质粒双切后直接乙醇沉淀
后做克隆可以吗？ 这样没有背景？我决定切下拉的片断应该也能沉淀下，这样就会有
背景啊。愿闻其祥，请赐教啊。
曾有labmate双切后用PCR纯化试剂盒做回收纯化，一直不成功，我提醒说这样酶切
的片断也能回收回来，不要迷信回收试剂盒，什么多大的片断回收不下来之类的全不可
靠。后来换胶回收就成功了。
NEB
DNA
，-
1-
【在 x*****e 的大作中提到】
: 看来做酶切的人还不少。其实双酶切分两步应该可行，先用对酶切要求比较高（查NEB
: 附录上需要保护碱基较多的酶）的酶切，反应完后加直接加第二个酶切：不用回收DNA
: 。这里有人问buffer不同怎么办的问题，查查哪里不同，一般也就是NaCl浓度差异，缺
: 啥补啥，自己加点调成第二个酶用的buffer就可以了。我现在空质粒双酶切完直接乙醇
: 沉淀回收（小片段沉淀不下来？）：加2倍体积无水乙醇，可选加1/10体积3M醋酸钠，-
: 20度大于20分钟，14000rpm*15min回收DNA,70% 乙醇洗2遍，风干后10-20ul水溶解（1-
: 2 ug DNA），如果有大的插入片段就走胶回收吧。
|
A*******e
发帖数: 284 | 25 我已经定到了这个公司的kit，正想试试，谢谢啦！
另外请问用过他们的plasmid kit吗？ mini的或max的，好用吗？
#
【在 d*********n 的大作中提到】
: 强烈建议用 MO BIO Laboratories, Inc的UltraClean DNA purification Kit (Cat #
: = 12100-300). 自从我摒弃QIAGEN的Kit,改用MO BIO的Kit以后，胶回收片段的回收率
: 一直很高很稳定(很强大)。我们实验室现在都在用这个KIT.
: GOOD LUCK!
|
s********n
发帖数: 2939 | 26 如果好用的话上来说一声！
谢了！
【在 A*******e 的大作中提到】
: 我已经定到了这个公司的kit，正想试试，谢谢啦！
: 另外请问用过他们的plasmid kit吗？ mini的或max的，好用吗？
:
: #
|
x*****e
发帖数: 309 | 27 比如XhoI这个酶需要的保护碱基比较多，需要6-7个，XhoI NNNN EcoR1,两者之间间隔
很小，可以先XhoI切。如果同时切，XhoINNNN 这样的分子就可能XhoI切不了。空质粒
双切后，小片段也就几十个碱基，乙醇沉淀大概原理就是中和DNA负电荷，直觉小片段
应该不容易沉淀（物化忘光了，好像分子直径大于多少就不能形成溶液），在我做过的
试验中背景很少（不加Insert的阴性对照，几乎没有克隆长出），但是没有设计针对背
景的实验。
【在 A*******e 的大作中提到】
: 我已经定到了这个公司的kit，正想试试，谢谢啦！
: 另外请问用过他们的plasmid kit吗？ mini的或max的，好用吗？
:
: #
|
