A*******e 发帖数: 284 | 1 也算是在分子这块混迹十几年,再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧,低
拷贝数质粒,要切的量很高,要求回收后能达到100ng/ul. 没办法,猛养细胞,猛提质
粒,所有的试剂盒被我抛弃,达不到我的要求,还费钱。手提,溶液1,2,3乙醇沉淀
什么的折腾,量上基本没有什么问题。 两个酶,Asc I 和 Not I, 双切,感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切,回收,问题来了,总是切不干净,转化后总有空
质粒,极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h, 酶的量也大大的多。
请问这是为啥? 这还能切不干净? 还有一个引申问题,是不是所有的酶切都是切不干
净的,如同化学里面的只能达到平衡?请高人指点。
附加问题,达人们有无什么胶回收试剂盒推荐? 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好,从没有达到所说的90% |
b******n 发帖数: 4225 | 2 可能你的DNA量太高了,稀释成几管切然后回收抽真空浓缩
这样效果不会差的
【在 A*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 也算是在分子这块混迹十几年,再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧,低 : 拷贝数质粒,要切的量很高,要求回收后能达到100ng/ul. 没办法,猛养细胞,猛提质 : 粒,所有的试剂盒被我抛弃,达不到我的要求,还费钱。手提,溶液1,2,3乙醇沉淀 : 什么的折腾,量上基本没有什么问题。 两个酶,Asc I 和 Not I, 双切,感谢NEB,这 : 两个酶现在可以在同一个buffer里切,回收,问题来了,总是切不干净,转化后总有空 : 质粒,极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h, 酶的量也大大的多。 : 请问这是为啥? 这还能切不干净? 还有一个引申问题,是不是所有的酶切都是切不干 : 净的,如同化学里面的只能达到平衡?请高人指点。 : 附加问题,达人们有无什么胶回收试剂盒推荐? 我总觉得现在用的QIA和Promega的效 : 率不好,从没有达到所说的90%
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p*****c 发帖数: 1506 | 3 不要用空质粒,
找一个这两个位点间有insert的质粒,酶切完以后跑胶,把大小不对没切完全的分掉
【在 A*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 也算是在分子这块混迹十几年,再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧,低 : 拷贝数质粒,要切的量很高,要求回收后能达到100ng/ul. 没办法,猛养细胞,猛提质 : 粒,所有的试剂盒被我抛弃,达不到我的要求,还费钱。手提,溶液1,2,3乙醇沉淀 : 什么的折腾,量上基本没有什么问题。 两个酶,Asc I 和 Not I, 双切,感谢NEB,这 : 两个酶现在可以在同一个buffer里切,回收,问题来了,总是切不干净,转化后总有空 : 质粒,极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h, 酶的量也大大的多。 : 请问这是为啥? 这还能切不干净? 还有一个引申问题,是不是所有的酶切都是切不干 : 净的,如同化学里面的只能达到平衡?请高人指点。 : 附加问题,达人们有无什么胶回收试剂盒推荐? 我总觉得现在用的QIA和Promega的效 : 率不好,从没有达到所说的90%
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A*******e 发帖数: 284 | 4 我大约在200ul体系里面加了几十ug的质粒,按理不算多了。
我也这么想的,在中间克隆一个2-3kb的片断进去,再利用分子量的差异回收。理论上
可行,但实际操作上还有困难,因为没有切开的质粒电泳是不按线性质粒规律的,跑得
要快一点,说不定也就赶上切开的质粒了 |
c****1 发帖数: 1095 | 5 酶切空质粒确实比较麻烦。我的经验是,一次酶切后,纯化,再酶切,再纯化,再酶切
。三轮过后,基本就没有没切开的了。
其实,插入片段也是个方法,你怕环状DNA跑的快,就插入个大点的片段,这个应该难
度不大。
BTW,为什么要这么大量?让我们开开眼? |
g*****y 发帖数: 6325 | 6 为什么要这么高的浓度转化呢? 我每次就切1ug. 胶回收,然后ligation, 转化都能挑
到正确得质粒。还有酶切一般我都不会
切超过2ug/tube. qiagen胶回收。
【在 A*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 也算是在分子这块混迹十几年,再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧,低 : 拷贝数质粒,要切的量很高,要求回收后能达到100ng/ul. 没办法,猛养细胞,猛提质 : 粒,所有的试剂盒被我抛弃,达不到我的要求,还费钱。手提,溶液1,2,3乙醇沉淀 : 什么的折腾,量上基本没有什么问题。 两个酶,Asc I 和 Not I, 双切,感谢NEB,这 : 两个酶现在可以在同一个buffer里切,回收,问题来了,总是切不干净,转化后总有空 : 质粒,极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h, 酶的量也大大的多。 : 请问这是为啥? 这还能切不干净? 还有一个引申问题,是不是所有的酶切都是切不干 : 净的,如同化学里面的只能达到平衡?请高人指点。 : 附加问题,达人们有无什么胶回收试剂盒推荐? 我总觉得现在用的QIA和Promega的效 : 率不好,从没有达到所说的90%
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g*****y 发帖数: 6325 | 7 200ul体积实在太大了。 酶切总体积不应该超过50ul. 如果需要切很多,应该分几个
tube, 比如5个tube, 40ul/tube. 跑胶
后在合并起来。我觉得你放太多dna。
【在 A*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我大约在200ul体系里面加了几十ug的质粒,按理不算多了。 : 我也这么想的,在中间克隆一个2-3kb的片断进去,再利用分子量的差异回收。理论上 : 可行,但实际操作上还有困难,因为没有切开的质粒电泳是不按线性质粒规律的,跑得 : 要快一点,说不定也就赶上切开的质粒了
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s******y 发帖数: 28562 | 8 I think the empty plasmid from your negative control cells are actually due
to self-ligation.
You may need to treat your cutted plasmid with Alkaline Phosphatase for 5~10
minutes right after digestion and then recover the cutted produt on agarose
.
【在 A*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 也算是在分子这块混迹十几年,再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧,低 : 拷贝数质粒,要切的量很高,要求回收后能达到100ng/ul. 没办法,猛养细胞,猛提质 : 粒,所有的试剂盒被我抛弃,达不到我的要求,还费钱。手提,溶液1,2,3乙醇沉淀 : 什么的折腾,量上基本没有什么问题。 两个酶,Asc I 和 Not I, 双切,感谢NEB,这 : 两个酶现在可以在同一个buffer里切,回收,问题来了,总是切不干净,转化后总有空 : 质粒,极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h, 酶的量也大大的多。 : 请问这是为啥? 这还能切不干净? 还有一个引申问题,是不是所有的酶切都是切不干 : 净的,如同化学里面的只能达到平衡?请高人指点。 : 附加问题,达人们有无什么胶回收试剂盒推荐? 我总觉得现在用的QIA和Promega的效 : 率不好,从没有达到所说的90%
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r**i 发帖数: 514 | 9 dna纯度对酶切效率有影响。
最好每次不要切很多,可以分多份切。
也算是在分子这块混迹十几年,再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧,低
拷贝数质粒,要切的量很高,要求回收后能达到100ng/ul. 没办法,猛养细胞,猛提质
粒,所有的试剂盒被我抛弃,达不到我的要求,还费钱。手提,溶液1,2,3乙醇沉淀
什么的折腾,量上基本没有什么问题。 两个酶,Asc I 和 Not I, 双切,感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切,回收,问题来了,总是切不干净,转化后总有空
质粒,极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h, 酶的量也大大的多。
请问这是为啥? 这还能切不干净? 还有一个引申问题,是不是所有的酶切都是切不干
净的,如同化学里面的只能达到平衡?请高人指点。
附加问题,达人们有无什么胶回收试剂盒推荐? 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好,从没有达到所说的90%
【在 A*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 也算是在分子这块混迹十几年,再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧,低 : 拷贝数质粒,要切的量很高,要求回收后能达到100ng/ul. 没办法,猛养细胞,猛提质 : 粒,所有的试剂盒被我抛弃,达不到我的要求,还费钱。手提,溶液1,2,3乙醇沉淀 : 什么的折腾,量上基本没有什么问题。 两个酶,Asc I 和 Not I, 双切,感谢NEB,这 : 两个酶现在可以在同一个buffer里切,回收,问题来了,总是切不干净,转化后总有空 : 质粒,极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h, 酶的量也大大的多。 : 请问这是为啥? 这还能切不干净? 还有一个引申问题,是不是所有的酶切都是切不干 : 净的,如同化学里面的只能达到平衡?请高人指点。 : 附加问题,达人们有无什么胶回收试剂盒推荐? 我总觉得现在用的QIA和Promega的效 : 率不好,从没有达到所说的90%
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g*****y 发帖数: 6325 | 10 如果用2个酶来切,两个sticky ends是不同得,自己ligate得几率很低。 根本不需要
用phosphatase.
due
10
agarose
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : I think the empty plasmid from your negative control cells are actually due : to self-ligation. : You may need to treat your cutted plasmid with Alkaline Phosphatase for 5~10 : minutes right after digestion and then recover the cutted produt on agarose : .
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h*****9 发帖数: 4028 | 11 太高了。通常都是1-2ug/50ul。另外你的酶量加太多Glycerol可能会对酶切不利。
回收只要是跑胶纯化,未梅切质粒污染应该非常少。
【在 A*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我大约在200ul体系里面加了几十ug的质粒,按理不算多了。 : 我也这么想的,在中间克隆一个2-3kb的片断进去,再利用分子量的差异回收。理论上 : 可行,但实际操作上还有困难,因为没有切开的质粒电泳是不按线性质粒规律的,跑得 : 要快一点,说不定也就赶上切开的质粒了
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g*****y 发帖数: 6325 | 12 general rule is : 加入得酶不超过酶切总体积得1/10.
【在 h*****9 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 太高了。通常都是1-2ug/50ul。另外你的酶量加太多Glycerol可能会对酶切不利。 : 回收只要是跑胶纯化,未梅切质粒污染应该非常少。
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s******y 发帖数: 28562 | 13 根据我自己的经验,这个并不确实。
有一个事情是,如果两个restriction site 距离得不是很远的话,有一个切了就会
影响到另外一个的切割效率,所以产物中会有一定比例的质粒是只被切了一刀的。
这种质粒会很容易被连接起来,所以不需要占产物的很高比例(即使只占1%)也能产生
很高的transformation effeciency.
【在 g*****y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果用2个酶来切,两个sticky ends是不同得,自己ligate得几率很低。 根本不需要 : 用phosphatase. : : due : 10 : agarose
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A*******e 发帖数: 284 | 14 谢谢诸位!我这个是因为需要建library,最好达到10(9),最低也得10(7)才
能说得过去,所以要求很高的浓度和效率。也有可能是自连,就是在两个酶只有一个酶
成功切了,而另外一个没有切的情况下,肯定自连。因为需要连接的效率,所以ALK之
类的处理被排除。也不想分布酶切,因为首先有共用buffer,其次我不想多纯化一次损
失我的vector.按诸位的意见,我打算降低单个酶切反应dna的量试试看。另外我这两个
酶切位点相距12bp,我想不会相互干扰。 这12bp中还有另外一个酶切位点,也是同样
的工作buffer,我想先用双酶切后,再加点这个酶,争取把那些漏网之鱼逮到干掉。
诸位有好主意,请不吝赐教!谢谢 |
m*********7 发帖数: 5207 | 15 In principle, two different sticky ends should not self ligate.
in reality, it happens all the time!
I still don't understand why after so many years, and I keep using
phosphatase under that circumstances.
【在 g*****y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果用2个酶来切,两个sticky ends是不同得,自己ligate得几率很低。 根本不需要 : 用phosphatase. : : due : 10 : agarose
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g*****y 发帖数: 6325 | 16 我双酶从来不用phosphotase, 从来没出过问题。
【在 m*********7 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : In principle, two different sticky ends should not self ligate. : in reality, it happens all the time! : I still don't understand why after so many years, and I keep using : phosphatase under that circumstances.
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C*******e 发帖数: 4348 | 17 反正你要胶回收的
酶切结束以后,只要是NEB的buffer 2,3 或者4,直接加点CIP进去37度1小时就可以了
然后一样胶回收
我不喜欢QIAGEN的胶回收kit
效率不高
绝对没有90%
lz可以试试ZymoResearch的胶回收kit
直接上他们家网站,要free sample
不喜欢也不用花钱买了
【在 A*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢诸位!我这个是因为需要建library,最好达到10(9),最低也得10(7)才 : 能说得过去,所以要求很高的浓度和效率。也有可能是自连,就是在两个酶只有一个酶 : 成功切了,而另外一个没有切的情况下,肯定自连。因为需要连接的效率,所以ALK之 : 类的处理被排除。也不想分布酶切,因为首先有共用buffer,其次我不想多纯化一次损 : 失我的vector.按诸位的意见,我打算降低单个酶切反应dna的量试试看。另外我这两个 : 酶切位点相距12bp,我想不会相互干扰。 这12bp中还有另外一个酶切位点,也是同样 : 的工作buffer,我想先用双酶切后,再加点这个酶,争取把那些漏网之鱼逮到干掉。 : 诸位有好主意,请不吝赐教!谢谢
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s********n 发帖数: 2939 | 18 以前只是做克隆,怎么折腾总能出要的东东。但现在做库的话就需要十分小心,我的制
备的vector几乎没有background,但链接效率不高,最终只能拿到1E7/ug vector。希
望能介绍一些提高链接效率的方法。 |
n***e 发帖数: 180 | 19 回收试一下fermentas的glass beads based DNA purification,大概回收率在8成左右
,qiagen的应该在5成以下 |
d*********n 发帖数: 10 | 20 强烈建议用 MO BIO Laboratories, Inc的UltraClean DNA purification Kit (Cat #
= 12100-300). 自从我摒弃QIAGEN的Kit,改用MO BIO的Kit以后,胶回收片段的回收率
一直很高很稳定(很强大)。我们实验室现在都在用这个KIT.
GOOD LUCK! |
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x*****e 发帖数: 309 | 21 看来做酶切的人还不少。其实双酶切分两步应该可行,先用对酶切要求比较高(查NEB
附录上需要保护碱基较多的酶)的酶切,反应完后加直接加第二个酶切:不用回收DNA
。这里有人问buffer不同怎么办的问题,查查哪里不同,一般也就是NaCl浓度差异,缺
啥补啥,自己加点调成第二个酶用的buffer就可以了。我现在空质粒双酶切完直接乙醇
沉淀回收(小片段沉淀不下来?):加2倍体积无水乙醇,可选加1/10体积3M醋酸钠,-
20度大于20分钟,14000rpm*15min回收DNA,70% 乙醇洗2遍,风干后10-20ul水溶解(1-
2 ug DNA),如果有大的插入片段就走胶回收吧。 |
s********n 发帖数: 2939 | 22 你建议的这个kit不是spin column的,这个公司的spin column的产品如何?
#
【在 d*********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 强烈建议用 MO BIO Laboratories, Inc的UltraClean DNA purification Kit (Cat # : = 12100-300). 自从我摒弃QIAGEN的Kit,改用MO BIO的Kit以后,胶回收片段的回收率 : 一直很高很稳定(很强大)。我们实验室现在都在用这个KIT. : GOOD LUCK!
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C*******e 发帖数: 4348 | 23 我推荐的ZymoResearch的是spin column
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你建议的这个kit不是spin column的,这个公司的spin column的产品如何? : : #
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A*******e 发帖数: 284 | 24 请问我两个酶有共用buffer,为什么还要分布切呢? 空质粒双切后直接乙醇沉淀
后做克隆可以吗? 这样没有背景?我决定切下拉的片断应该也能沉淀下,这样就会有
背景啊。愿闻其祥,请赐教啊。
曾有labmate双切后用PCR纯化试剂盒做回收纯化,一直不成功,我提醒说这样酶切
的片断也能回收回来,不要迷信回收试剂盒,什么多大的片断回收不下来之类的全不可
靠。后来换胶回收就成功了。
NEB
DNA
,-
1-
【在 x*****e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 看来做酶切的人还不少。其实双酶切分两步应该可行,先用对酶切要求比较高(查NEB : 附录上需要保护碱基较多的酶)的酶切,反应完后加直接加第二个酶切:不用回收DNA : 。这里有人问buffer不同怎么办的问题,查查哪里不同,一般也就是NaCl浓度差异,缺 : 啥补啥,自己加点调成第二个酶用的buffer就可以了。我现在空质粒双酶切完直接乙醇 : 沉淀回收(小片段沉淀不下来?):加2倍体积无水乙醇,可选加1/10体积3M醋酸钠,- : 20度大于20分钟,14000rpm*15min回收DNA,70% 乙醇洗2遍,风干后10-20ul水溶解(1- : 2 ug DNA),如果有大的插入片段就走胶回收吧。
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A*******e 发帖数: 284 | 25 我已经定到了这个公司的kit,正想试试,谢谢啦!
另外请问用过他们的plasmid kit吗? mini的或max的,好用吗?
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【在 d*********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 强烈建议用 MO BIO Laboratories, Inc的UltraClean DNA purification Kit (Cat # : = 12100-300). 自从我摒弃QIAGEN的Kit,改用MO BIO的Kit以后,胶回收片段的回收率 : 一直很高很稳定(很强大)。我们实验室现在都在用这个KIT. : GOOD LUCK!
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s********n 发帖数: 2939 | 26 如果好用的话上来说一声!
谢了!
【在 A*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我已经定到了这个公司的kit,正想试试,谢谢啦! : 另外请问用过他们的plasmid kit吗? mini的或max的,好用吗? : : #
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x*****e 发帖数: 309 | 27 比如XhoI这个酶需要的保护碱基比较多,需要6-7个,XhoI NNNN EcoR1,两者之间间隔
很小,可以先XhoI切。如果同时切,XhoINNNN 这样的分子就可能XhoI切不了。空质粒
双切后,小片段也就几十个碱基,乙醇沉淀大概原理就是中和DNA负电荷,直觉小片段
应该不容易沉淀(物化忘光了,好像分子直径大于多少就不能形成溶液),在我做过的
试验中背景很少(不加Insert的阴性对照,几乎没有克隆长出),但是没有设计针对背
景的实验。
【在 A*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我已经定到了这个公司的kit,正想试试,谢谢啦! : 另外请问用过他们的plasmid kit吗? mini的或max的,好用吗? : : #
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