w******e
发帖数: 1187 | 1 用radiolabeled RNA aptamer+varying amount of protein，gel shift测affinity，
develop出来所有的protein concentration都只有一条很靠近加样口的band（很
怀疑根本没进gel），而且确定跟aptamer alone的band不是一条。请教有人遇到
这种情况没有？and如果确定了那条band根本就是在加样口附近，问题怎么解决？
protein确实挺大（250kd），但不应该进不了gel。
//bow |
a****o
发帖数: 1786 | 2 Did you use agarose or polyacrylamide gel?
Try to add some BSA and tRNA as nonspecific competitors.
Does your protein tend to form oligomer?
You can also try to add some DTT. |
s******y
发帖数: 28562 | 3 Most likely is protein aggregation
Did you run a control with protein alone?
【在 w******e 的大作中提到】
: 用radiolabeled RNA aptamer+varying amount of protein，gel shift测affinity，
: develop出来所有的protein concentration都只有一条很靠近加样口的band（很
: 怀疑根本没进gel），而且确定跟aptamer alone的band不是一条。请教有人遇到
: 这种情况没有？and如果确定了那条band根本就是在加样口附近，问题怎么解决？
: protein确实挺大（250kd），但不应该进不了gel。
: //bow
|
w******e
发帖数: 1187 | 4 I used native PAGE gel. I kinda hesitate to use competitors as I
don't know how that would affect aptamer band formation (e.g., would
there be an aptamer-BSA band if I add BSA?).
I also suspect oligomer, but even that can't explain why all my
aptamers are sucked onto it...@@
BTW, I actually tried doing ELISA against the same target using
biotinylated RNA, and that worked out fine.
【在 a****o 的大作中提到】
: Did you use agarose or polyacrylamide gel?
: Try to add some BSA and tRNA as nonspecific competitors.
: Does your protein tend to form oligomer?
: You can also try to add some DTT.
|
w******e
发帖数: 1187 | 5 Thanks for the info. but protein alone wouldn't have signal since it's
not labeled
【在 s******y 的大作中提到】
: Most likely is protein aggregation
: Did you run a control with protein alone?
|
T**********t
发帖数: 1604 | 6 这个蛋白的pI值多少？你的native gel的pH值多少？如果两者相差不多，那么蛋白q迁
移会相当慢。 |
w******e
发帖数: 1187 | 7 土了，第一次听说还可以调native gel的pH。。。我猜应该在7左右？target pI ~5，
ms应该travel的比较快？
【在 T**********t 的大作中提到】
: 这个蛋白的pI值多少？你的native gel的pH值多少？如果两者相差不多，那么蛋白q迁
: 移会相当慢。
|
a****k
发帖数: 1130 | 8 发一下你胶的配方好了，多少percent的
【在 w******e 的大作中提到】
: I used native PAGE gel. I kinda hesitate to use competitors as I
: don't know how that would affect aptamer band formation (e.g., would
: there be an aptamer-BSA band if I add BSA?).
: I also suspect oligomer, but even that can't explain why all my
: aptamers are sucked onto it...@@
: BTW, I actually tried doing ELISA against the same target using
: biotinylated RNA, and that worked out fine.
|
w******e
发帖数: 1187 | 9 DI H2O 34.64 mL
10x TBE 5 mL
40% acrylamide 10 mL
10% APS 300 L
TEMED 60 L
Total 50 mL
it's a 8% PAGE gel. thx!
【在 a****k 的大作中提到】
: 发一下你胶的配方好了，多少percent的
|
s******y
发帖数: 28562 | 10 8%的胶用来跑250kD的蛋白可不行。万一是双聚体就悲剧了。
这么大的蛋白，我一般都是用4-15%胶的。
【在 w******e 的大作中提到】
: DI H2O 34.64 mL
: 10x TBE 5 mL
: 40% acrylamide 10 mL
: 10% APS 300 L
: TEMED 60 L
: Total 50 mL
: it's a 8% PAGE gel. thx!
|
|
|
T**********t
发帖数: 1604 | 11 TBE的pH是8.3左右，你的蛋白如果pI是5应该跑得没问题的。但是250kD确实太大了，8%
的胶可能浓度还是高了。你要不要试试用5%的胶或者干脆用Agarose胶跑跑？我没用过
Agarose胶跑蛋白但我知道是可以用的。另外你最好还是确认一下在这个条件下蛋白有
没有aggregation，可以用Analytical Ultracentrifugation来看蛋白的aggregation，
不过那个实验用的蛋白量比较大。 |
w******e
发帖数: 1187 | 12 土问：啥叫4-15% gel啊？gradient？
实话说我对native gel跑蛋白一直没搞明白原理。是不是只有跟aptamer bind了
之后才会带负电才会migrate？那感觉应该比SDS的效果差非常非常多？刚才有
铜锈指出还能调gel pH，完全不知，窘了。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 8%的胶用来跑250kD的蛋白可不行。万一是双聚体就悲剧了。
: 这么大的蛋白，我一般都是用4-15%胶的。
|
w******e
发帖数: 1187 | 13 多谢啦！我也确实偷懒，担心low conc.的gel太软就没折腾。。。
8%
【在 T**********t 的大作中提到】
: TBE的pH是8.3左右，你的蛋白如果pI是5应该跑得没问题的。但是250kD确实太大了，8%
: 的胶可能浓度还是高了。你要不要试试用5%的胶或者干脆用Agarose胶跑跑？我没用过
: Agarose胶跑蛋白但我知道是可以用的。另外你最好还是确认一下在这个条件下蛋白有
: 没有aggregation，可以用Analytical Ultracentrifugation来看蛋白的aggregation，
: 不过那个实验用的蛋白量比较大。
|
V********n
发帖数: 305 | 14 250KD蛋白太大了，如果再来点高级结构很难弄的。这个试验很难搞啊。可以试试UV-
crosslink，然后跑denature的胶。 |
s******y
发帖数: 28562 | 15 你的那个蛋白如果pI ~5 的话，在pH 7 buffer里面这个蛋白就是带负电的，
应该自己就能往正极跑，和RNA同一个方向
另外，调节native gel pH 太正常了，不然很多蛋白都不能跑了。
4-15% gel 就是gradien gel， 如果你自己不会做可以去买现成的。
【在 w******e 的大作中提到】
: 土问：啥叫4-15% gel啊？gradient？
: 实话说我对native gel跑蛋白一直没搞明白原理。是不是只有跟aptamer bind了
: 之后才会带负电才会migrate？那感觉应该比SDS的效果差非常非常多？刚才有
: 铜锈指出还能调gel pH，完全不知，窘了。。。
|
O******e
发帖数: 4845 | 16 兄弟，花几个小钱去买现成的胶吧，出结果快。这些小实验说是简单，但一些小细节
弄错了，时间上真是耗不起。
【在 w******e 的大作中提到】
: 土问：啥叫4-15% gel啊？gradient？
: 实话说我对native gel跑蛋白一直没搞明白原理。是不是只有跟aptamer bind了
: 之后才会带负电才会migrate？那感觉应该比SDS的效果差非常非常多？刚才有
: 铜锈指出还能调gel pH，完全不知，窘了。。。
|
w******e
发帖数: 1187 | 17 多谢各位的建议！惭愧，贪进度很多实验没搞清原理就先做上了呵呵
我决定随便试试简单的，还不行就做filter binding去算了，今天在试了
第四次filter binding之后终于work了~
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的那个蛋白如果pI ~5 的话，在pH 7 buffer里面这个蛋白就是带负电的，
: 应该自己就能往正极跑，和RNA同一个方向
: 另外，调节native gel pH 太正常了，不然很多蛋白都不能跑了。
: 4-15% gel 就是gradien gel， 如果你自己不会做可以去买现成的。
|
T**********t
发帖数: 1604 | 18 你进度已经很神速了。。。一天问一个新实验啊，我简直惭愧死了。
【在 w******e 的大作中提到】
: 多谢各位的建议！惭愧，贪进度很多实验没搞清原理就先做上了呵呵
: 我决定随便试试简单的，还不行就做filter binding去算了，今天在试了
: 第四次filter binding之后终于work了~
|
w******e
发帖数: 1187 | 19 哪能都是最近做的啊，只不过最近版上学术气氛比较好，借人气把该问的都
问了呵呵。话说前段时间所有kd measurement方法在我手上都不work。。。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 你进度已经很神速了。。。一天问一个新实验啊，我简直惭愧死了。
|
g*******0
发帖数: 2152 | 20 我做 EMSA 都是用4% 或6% PAGE (arc:bis 1:19)。如果蛋白加多了，即使是蛋白分子
不大，radioactive 也会都留在孔里。没买过 gradient gel 做 EMSA,是不是得注意
buffer system? |
|
|
w******e
发帖数: 1187 | 21 这样啊?!你知道是什么原理让probe都粘到蛋白上吗？你通常用多少浓度? TBE buffer?
多谢！
【在 g*******0 的大作中提到】
: 我做 EMSA 都是用4% 或6% PAGE (arc:bis 1:19)。如果蛋白加多了，即使是蛋白分子
: 不大，radioactive 也会都留在孔里。没买过 gradient gel 做 EMSA,是不是得注意
: buffer system?
|
a****o
发帖数: 1786 | 22 One extra lane will tell you if your aptamer bind to BSA. This is kind of
necessary control. you need to show ur aptamer not bind to any unrelated
proteins.
you can try 0.5x TBE, lower concentrration of acrylamide, I usually use 6%.
I tried 4% before, it is not a big deal.
silicate only one plate, it is very easy to separate your gel from that
plate, but stick to the other plate. put one a piece of DE filter will
transfer the whole gel to filter.
Good luck.
I suspect the protein gel system will
【在 w******e 的大作中提到】
: I used native PAGE gel. I kinda hesitate to use competitors as I
: don't know how that would affect aptamer band formation (e.g., would
: there be an aptamer-BSA band if I add BSA?).
: I also suspect oligomer, but even that can't explain why all my
: aptamers are sucked onto it...@@
: BTW, I actually tried doing ELISA against the same target using
: biotinylated RNA, and that worked out fine.
|
w******e
发帖数: 1187 | 23 Thanks a lot for the detailed information! I'll give an update if
I made some progress on this:)
.
【在 a****o 的大作中提到】
: One extra lane will tell you if your aptamer bind to BSA. This is kind of
: necessary control. you need to show ur aptamer not bind to any unrelated
: proteins.
: you can try 0.5x TBE, lower concentrration of acrylamide, I usually use 6%.
: I tried 4% before, it is not a big deal.
: silicate only one plate, it is very easy to separate your gel from that
: plate, but stick to the other plate. put one a piece of DE filter will
: transfer the whole gel to filter.
: Good luck.
: I suspect the protein gel system will
|
x**y
发帖数: 46 | 24 跟我最近的EMSA相似，给你一些有用的意见：
1. 如果你的蛋白有aggregation，加一些Triton100(0.1，0.5or1%). 听很多人说，这
很有用。
2. 用4-12% TBE gel （Invitrogen）。如果自己配，用4%。或者3%，下层加三分之一
15%防止free probe run out。
3. 如果还不行，用垂直配胶系统（Bio-rad配PAGE gel用的， 1.5mM）配Agrose胶（1%
？ 2%？记不清了）。里面可以加Triton & glycerol。
我的蛋白80kD， oligomerization 后500 or 1000kD （FPLC测定）。6%TBE gel完全在
well上，4-12%能进一点点，3%可完全进入但很难看。最近我们lab新来的Postdoc用了
Agrose胶，效果不错。我让他加了一些Triton & glycerol，效果更好了，binding
affinity 都增加了几倍。但具体浓度，我得问问他。 |
w******e
发帖数: 1187 | 25 thank you so much!! I'll save your post as refence:)
1%
【在 x**y 的大作中提到】
: 跟我最近的EMSA相似，给你一些有用的意见：
: 1. 如果你的蛋白有aggregation，加一些Triton100(0.1，0.5or1%). 听很多人说，这
: 很有用。
: 2. 用4-12% TBE gel （Invitrogen）。如果自己配，用4%。或者3%，下层加三分之一
: 15%防止free probe run out。
: 3. 如果还不行，用垂直配胶系统（Bio-rad配PAGE gel用的， 1.5mM）配Agrose胶（1%
: ？ 2%？记不清了）。里面可以加Triton & glycerol。
: 我的蛋白80kD， oligomerization 后500 or 1000kD （FPLC测定）。6%TBE gel完全在
: well上，4-12%能进一点点，3%可完全进入但很难看。最近我们lab新来的Postdoc用了
: Agrose胶，效果不错。我让他加了一些Triton & glycerol，效果更好了，binding
|
y*****1
发帖数: 73 | 26 Why can't? the movement is all about PI in native gel
【在 w******e 的大作中提到】
: 土了，第一次听说还可以调native gel的pH。。。我猜应该在7左右？target pI ~5，
: ms应该travel的比较快？
|
