h*****n
发帖数: 2023 | 1 最近在研究一个很大的蛋白，有2500个氨基酸。我在这个蛋白的N端加了个FLag。筛了
稳定表达细胞系，用FLAG抗体检测不到蛋白的表达，但我用这个蛋白本身的抗体可以检
测到很强的信号。我以为FLAG序列没有表达，然后就做了FLAG IP，接着用蛋白本身的
抗体看看FLag能否沉下蛋白，结果发现FLAG能能沉下蛋白，比INPUT多。因为实验需要
，只能用1xFLAG,而不能用3XFLAG.FLAG抗体做IP比western灵敏吗？为什么我的western
检测不到？ |
s*********s
发帖数: 110 | 2 有一个问题
IP出来的怎么会比input多呢？
你input control是10% input还是所有的啊？ |
h*****n
发帖数: 2023 | 3 1/50
【在 s*********s 的大作中提到】
: 有一个问题
: IP出来的怎么会比input多呢？
: 你input control是10% input还是所有的啊？
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s*********s
发帖数: 110 | 4 所以，IP比1/50 input多是正常的
你前面的结果，对于stable cell line
用蛋白本身的抗体做western，ectopic expression的stable cell line比control
cell line高多少？
我有一个hypothesis,需要你更多的information才能判断.
western
【在 h*****n 的大作中提到】
: 最近在研究一个很大的蛋白，有2500个氨基酸。我在这个蛋白的N端加了个FLag。筛了
: 稳定表达细胞系，用FLAG抗体检测不到蛋白的表达，但我用这个蛋白本身的抗体可以检
: 测到很强的信号。我以为FLAG序列没有表达，然后就做了FLAG IP，接着用蛋白本身的
: 抗体看看FLag能否沉下蛋白，结果发现FLAG能能沉下蛋白，比INPUT多。因为实验需要
: ，只能用1xFLAG,而不能用3XFLAG.FLAG抗体做IP比western灵敏吗？为什么我的western
: 检测不到？
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t******y
发帖数: 716 | 5 增加抗体浓度。譬如原先1：1000稀释，现在1：200稀释，估计可以看到。我也碰到类
似的情况。 |
s****l
发帖数: 395 | 6 我觉得是1*tag的问题，用3*tag应该好些，我表达一个1*HA tag的蛋白作stable line
，筛选的时候用HA的抗体根本没信号，用该蛋白的抗体可以看到比endogenous强的
shift band
western
【在 h*****n 的大作中提到】
: 最近在研究一个很大的蛋白，有2500个氨基酸。我在这个蛋白的N端加了个FLag。筛了
: 稳定表达细胞系，用FLAG抗体检测不到蛋白的表达，但我用这个蛋白本身的抗体可以检
: 测到很强的信号。我以为FLAG序列没有表达，然后就做了FLAG IP，接着用蛋白本身的
: 抗体看看FLag能否沉下蛋白，结果发现FLAG能能沉下蛋白，比INPUT多。因为实验需要
: ，只能用1xFLAG,而不能用3XFLAG.FLAG抗体做IP比western灵敏吗？为什么我的western
: 检测不到？
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h*****n
发帖数: 2023 | 7
高很多，甚至一度觉得表达太高了。
【在 s*********s 的大作中提到】
: 所以，IP比1/50 input多是正常的
: 你前面的结果，对于stable cell line
: 用蛋白本身的抗体做western，ectopic expression的stable cell line比control
: cell line高多少？
: 我有一个hypothesis,需要你更多的information才能判断.
:
: western
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