v***a
发帖数: 1242 | 1 我在研究一个蛋白，它是一个跨膜蛋白，有胞外域和胞内域两个部分（见附图，在2楼
）。胞外域和胞内域在某种信号的介导下，会被一切两段，胞外域的那一段就会从细胞
表面上脱落，游离到体液（in vivo）或培养液（in vitro）中（不过也有可能掉回细
胞内出现在tissue/cell lysate中？）；而胞内域的那一段（包括跨膜域）就残留在细
胞膜上。
最初做in vivo时，我买了两个单克隆抗体（当时还不知道这个蛋白会被一切两段），
它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band（IB），
后来又买了两个多克隆抗体，可以检测出一条符合预期的band，以及那条上面的单抗可
以检测出的较短的band。然后又查了文献，猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的
缘故。
两个单抗都是raised against此蛋白的胞外域，而两个多抗是against胞内域。但是不
清楚为什么单抗就检测不出full length的蛋白（现在想可能因为mAb无法识别full
length的conformation？大家觉得这个猜测对吗？）
现在开始做in vitro的细胞培养， |
v***a
发帖数: 1242 | 2 为什么我图片要么粘不上，要么粘上了也无法看？急啊
【在 v***a 的大作中提到】
: 我在研究一个蛋白，它是一个跨膜蛋白，有胞外域和胞内域两个部分（见附图，在2楼
: ）。胞外域和胞内域在某种信号的介导下，会被一切两段，胞外域的那一段就会从细胞
: 表面上脱落，游离到体液（in vivo）或培养液（in vitro）中（不过也有可能掉回细
: 胞内出现在tissue/cell lysate中？）；而胞内域的那一段（包括跨膜域）就残留在细
: 胞膜上。
: 最初做in vivo时，我买了两个单克隆抗体（当时还不知道这个蛋白会被一切两段），
: 它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band（IB），
: 后来又买了两个多克隆抗体，可以检测出一条符合预期的band，以及那条上面的单抗可
: 以检测出的较短的band。然后又查了文献，猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的
: 缘故。
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s******y
发帖数: 28562 | 3 关于你的那个单抗检测不到full length 的情况，其实很有可能是你上样量的问题。很
多这些蛋白，在某些条件下是以cleaved form 为主，full length非常少，而且有些情
况下，外面的那段一旦被切了，会导致胞内的那一段很快被降解。 所以你的样品里大
部分带都是体外的那一段。但是如果你提高上样量的话，用那些检测体外段的单抗叶也
能看到很小的一条full length.
至于那个多抗，因为它只检测full length, 对体外的那一段视而不见，所以在适当的
稀释度下可以看到full length.
至于第二个问题，有几个可能，一个是这个蛋白经过其他修饰之后可以被分泌出去，所
以用多抗可以看到一个不同的分子量的带。另外一个可能就是培养液里面的死细胞被降
解的残片。要分辨着两个情况的话有很多方法，你具体和你的老板讨论吧。我就不多讲
了。
【在 v***a 的大作中提到】
: 我在研究一个蛋白，它是一个跨膜蛋白，有胞外域和胞内域两个部分（见附图，在2楼
: ）。胞外域和胞内域在某种信号的介导下，会被一切两段，胞外域的那一段就会从细胞
: 表面上脱落，游离到体液（in vivo）或培养液（in vitro）中（不过也有可能掉回细
: 胞内出现在tissue/cell lysate中？）；而胞内域的那一段（包括跨膜域）就残留在细
: 胞膜上。
: 最初做in vivo时，我买了两个单克隆抗体（当时还不知道这个蛋白会被一切两段），
: 它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band（IB），
: 后来又买了两个多克隆抗体，可以检测出一条符合预期的band，以及那条上面的单抗可
: 以检测出的较短的band。然后又查了文献，猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的
: 缘故。
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v***a
发帖数: 1242 | 4 图片终于粘上了，谢谢大家帮助
【在 v***a 的大作中提到】
: 我在研究一个蛋白，它是一个跨膜蛋白，有胞外域和胞内域两个部分（见附图，在2楼
: ）。胞外域和胞内域在某种信号的介导下，会被一切两段，胞外域的那一段就会从细胞
: 表面上脱落，游离到体液（in vivo）或培养液（in vitro）中（不过也有可能掉回细
: 胞内出现在tissue/cell lysate中？）；而胞内域的那一段（包括跨膜域）就残留在细
: 胞膜上。
: 最初做in vivo时，我买了两个单克隆抗体（当时还不知道这个蛋白会被一切两段），
: 它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band（IB），
: 后来又买了两个多克隆抗体，可以检测出一条符合预期的band，以及那条上面的单抗可
: 以检测出的较短的band。然后又查了文献，猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的
: 缘故。
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s******y
发帖数: 28562 | 5 我看到了啊，第一张，你手画的那个。
可能是尺寸太大？看起来特别慢。你可以把图片缩小一点再传
【在 v***a 的大作中提到】
: 为什么我图片要么粘不上，要么粘上了也无法看？急啊
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b******n
发帖数: 4225 | 6 alternative cleavage
tissue: A, B
cell culture: A+B1, B2
B1+B2=B
【在 v***a 的大作中提到】
: 我在研究一个蛋白，它是一个跨膜蛋白，有胞外域和胞内域两个部分（见附图，在2楼
: ）。胞外域和胞内域在某种信号的介导下，会被一切两段，胞外域的那一段就会从细胞
: 表面上脱落，游离到体液（in vivo）或培养液（in vitro）中（不过也有可能掉回细
: 胞内出现在tissue/cell lysate中？）；而胞内域的那一段（包括跨膜域）就残留在细
: 胞膜上。
: 最初做in vivo时，我买了两个单克隆抗体（当时还不知道这个蛋白会被一切两段），
: 它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band（IB），
: 后来又买了两个多克隆抗体，可以检测出一条符合预期的band，以及那条上面的单抗可
: 以检测出的较短的band。然后又查了文献，猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的
: 缘故。
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v***a
发帖数: 1242 | 7 呵呵 真神奇 你看到了？我自己打开来都是一个×。不过修改了一下，又重新传上来了
谢谢你的解释啊 我还在慢慢消化体会中。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我看到了啊，第一张，你手画的那个。
: 可能是尺寸太大？看起来特别慢。你可以把图片缩小一点再传
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v***a
发帖数: 1242 | 8 我用多抗检测tissue中时
一般情况下都是full length的band非常清晰
cleaved form的那条短band很浅
但是单抗就只有很粗的cleaved form那一条
还有我没有很看明白你说的
多抗如果target的是胞内的那一段
那么它是怎么可以检测到cleaved form的？
【在 s******y 的大作中提到】
: 关于你的那个单抗检测不到full length 的情况，其实很有可能是你上样量的问题。很
: 多这些蛋白，在某些条件下是以cleaved form 为主，full length非常少，而且有些情
: 况下，外面的那段一旦被切了，会导致胞内的那一段很快被降解。 所以你的样品里大
: 部分带都是体外的那一段。但是如果你提高上样量的话，用那些检测体外段的单抗叶也
: 能看到很小的一条full length.
: 至于那个多抗，因为它只检测full length, 对体外的那一段视而不见，所以在适当的
: 稀释度下可以看到full length.
: 至于第二个问题，有几个可能，一个是这个蛋白经过其他修饰之后可以被分泌出去，所
: 以用多抗可以看到一个不同的分子量的带。另外一个可能就是培养液里面的死细胞被降
: 解的残片。要分辨着两个情况的话有很多方法，你具体和你的老板讨论吧。我就不多讲
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v***a
发帖数: 1242 | 9 谢谢你提供的这个思路
我去查查文献
【在 b******n 的大作中提到】
: alternative cleavage
: tissue: A, B
: cell culture: A+B1, B2
: B1+B2=B
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