v***a 发帖数: 1242 | 1 我在研究一个蛋白,它是一个跨膜蛋白,有胞外域和胞内域两个部分(见附图,在2楼
)。胞外域和胞内域在某种信号的介导下,会被一切两段,胞外域的那一段就会从细胞
表面上脱落,游离到体液(in vivo)或培养液(in vitro)中(不过也有可能掉回细
胞内出现在tissue/cell lysate中?);而胞内域的那一段(包括跨膜域)就残留在细
胞膜上。
最初做in vivo时,我买了两个单克隆抗体(当时还不知道这个蛋白会被一切两段),
它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band(IB),
后来又买了两个多克隆抗体,可以检测出一条符合预期的band,以及那条上面的单抗可
以检测出的较短的band。然后又查了文献,猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的
缘故。
两个单抗都是raised against此蛋白的胞外域,而两个多抗是against胞内域。但是不
清楚为什么单抗就检测不出full length的蛋白(现在想可能因为mAb无法识别full
length的conformation?大家觉得这个猜测对吗?)
现在开始做in vitro的细胞培养, |
v***a 发帖数: 1242 | 2 为什么我图片要么粘不上,要么粘上了也无法看?急啊
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我在研究一个蛋白,它是一个跨膜蛋白,有胞外域和胞内域两个部分(见附图,在2楼 : )。胞外域和胞内域在某种信号的介导下,会被一切两段,胞外域的那一段就会从细胞 : 表面上脱落,游离到体液(in vivo)或培养液(in vitro)中(不过也有可能掉回细 : 胞内出现在tissue/cell lysate中?);而胞内域的那一段(包括跨膜域)就残留在细 : 胞膜上。 : 最初做in vivo时,我买了两个单克隆抗体(当时还不知道这个蛋白会被一切两段), : 它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band(IB), : 后来又买了两个多克隆抗体,可以检测出一条符合预期的band,以及那条上面的单抗可 : 以检测出的较短的band。然后又查了文献,猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的 : 缘故。
|
s******y 发帖数: 28562 | 3 关于你的那个单抗检测不到full length 的情况,其实很有可能是你上样量的问题。很
多这些蛋白,在某些条件下是以cleaved form 为主,full length非常少,而且有些情
况下,外面的那段一旦被切了,会导致胞内的那一段很快被降解。 所以你的样品里大
部分带都是体外的那一段。但是如果你提高上样量的话,用那些检测体外段的单抗叶也
能看到很小的一条full length.
至于那个多抗,因为它只检测full length, 对体外的那一段视而不见,所以在适当的
稀释度下可以看到full length.
至于第二个问题,有几个可能,一个是这个蛋白经过其他修饰之后可以被分泌出去,所
以用多抗可以看到一个不同的分子量的带。另外一个可能就是培养液里面的死细胞被降
解的残片。要分辨着两个情况的话有很多方法,你具体和你的老板讨论吧。我就不多讲
了。
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我在研究一个蛋白,它是一个跨膜蛋白,有胞外域和胞内域两个部分(见附图,在2楼 : )。胞外域和胞内域在某种信号的介导下,会被一切两段,胞外域的那一段就会从细胞 : 表面上脱落,游离到体液(in vivo)或培养液(in vitro)中(不过也有可能掉回细 : 胞内出现在tissue/cell lysate中?);而胞内域的那一段(包括跨膜域)就残留在细 : 胞膜上。 : 最初做in vivo时,我买了两个单克隆抗体(当时还不知道这个蛋白会被一切两段), : 它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band(IB), : 后来又买了两个多克隆抗体,可以检测出一条符合预期的band,以及那条上面的单抗可 : 以检测出的较短的band。然后又查了文献,猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的 : 缘故。
|
v***a 发帖数: 1242 | 4 图片终于粘上了,谢谢大家帮助
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我在研究一个蛋白,它是一个跨膜蛋白,有胞外域和胞内域两个部分(见附图,在2楼 : )。胞外域和胞内域在某种信号的介导下,会被一切两段,胞外域的那一段就会从细胞 : 表面上脱落,游离到体液(in vivo)或培养液(in vitro)中(不过也有可能掉回细 : 胞内出现在tissue/cell lysate中?);而胞内域的那一段(包括跨膜域)就残留在细 : 胞膜上。 : 最初做in vivo时,我买了两个单克隆抗体(当时还不知道这个蛋白会被一切两段), : 它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band(IB), : 后来又买了两个多克隆抗体,可以检测出一条符合预期的band,以及那条上面的单抗可 : 以检测出的较短的band。然后又查了文献,猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的 : 缘故。
|
s******y 发帖数: 28562 | 5 我看到了啊,第一张,你手画的那个。
可能是尺寸太大?看起来特别慢。你可以把图片缩小一点再传
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 为什么我图片要么粘不上,要么粘上了也无法看?急啊
|
b******n 发帖数: 4225 | 6 alternative cleavage
tissue: A, B
cell culture: A+B1, B2
B1+B2=B
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我在研究一个蛋白,它是一个跨膜蛋白,有胞外域和胞内域两个部分(见附图,在2楼 : )。胞外域和胞内域在某种信号的介导下,会被一切两段,胞外域的那一段就会从细胞 : 表面上脱落,游离到体液(in vivo)或培养液(in vitro)中(不过也有可能掉回细 : 胞内出现在tissue/cell lysate中?);而胞内域的那一段(包括跨膜域)就残留在细 : 胞膜上。 : 最初做in vivo时,我买了两个单克隆抗体(当时还不知道这个蛋白会被一切两段), : 它们都只能检测出tissue lysate中比预期的蛋白分子量要小好多的一条band(IB), : 后来又买了两个多克隆抗体,可以检测出一条符合预期的band,以及那条上面的单抗可 : 以检测出的较短的band。然后又查了文献,猜测可能是由于胞内域和胞外域蛋白分离的 : 缘故。
|
v***a 发帖数: 1242 | 7 呵呵 真神奇 你看到了?我自己打开来都是一个×。不过修改了一下,又重新传上来了
谢谢你的解释啊 我还在慢慢消化体会中。。。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我看到了啊,第一张,你手画的那个。 : 可能是尺寸太大?看起来特别慢。你可以把图片缩小一点再传
|
v***a 发帖数: 1242 | 8 我用多抗检测tissue中时
一般情况下都是full length的band非常清晰
cleaved form的那条短band很浅
但是单抗就只有很粗的cleaved form那一条
还有我没有很看明白你说的
多抗如果target的是胞内的那一段
那么它是怎么可以检测到cleaved form的?
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 关于你的那个单抗检测不到full length 的情况,其实很有可能是你上样量的问题。很 : 多这些蛋白,在某些条件下是以cleaved form 为主,full length非常少,而且有些情 : 况下,外面的那段一旦被切了,会导致胞内的那一段很快被降解。 所以你的样品里大 : 部分带都是体外的那一段。但是如果你提高上样量的话,用那些检测体外段的单抗叶也 : 能看到很小的一条full length. : 至于那个多抗,因为它只检测full length, 对体外的那一段视而不见,所以在适当的 : 稀释度下可以看到full length. : 至于第二个问题,有几个可能,一个是这个蛋白经过其他修饰之后可以被分泌出去,所 : 以用多抗可以看到一个不同的分子量的带。另外一个可能就是培养液里面的死细胞被降 : 解的残片。要分辨着两个情况的话有很多方法,你具体和你的老板讨论吧。我就不多讲
|
v***a 发帖数: 1242 | 9 谢谢你提供的这个思路
我去查查文献
【在 b******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : alternative cleavage : tissue: A, B : cell culture: A+B1, B2 : B1+B2=B
|