C*******e
发帖数: 4348 | 1 rt
想请教一下如果现在有细胞Lysate（破碎细胞以后9-10k rpm离心上清），
大量（50-100ml）
想按照蛋白大小快速粗分离
比如30kDa左右为分界
有没有什么好方法？ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 1. memrane filter? I would recommend using the inverted filter set in order
to protect the activities of the proteins.
2. high speed centrifugation with sucrose cushion?
3. a short, fat, gel filtration column?
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 想请教一下如果现在有细胞Lysate（破碎细胞以后9-10k rpm离心上清），
: 大量（50-100ml）
: 想按照蛋白大小快速粗分离
: 比如30kDa左右为分界
: 有没有什么好方法？
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C*******e
发帖数: 4348 | 3 membrane filter会不会很贵？刚才看了spectrum labs公司的，没有30 kDa的选择，只有
20kDa，或是50kDa的。
透析有个25 kda的，但是不确定到底要花多久
有又粗又短的gel filtration column存在么？不管怎么说50ml都是比较大的体积了
不清楚是不是有什么old school的方法
order
【在 s******y 的大作中提到】
: 1. memrane filter? I would recommend using the inverted filter set in order
: to protect the activities of the proteins.
: 2. high speed centrifugation with sucrose cushion?
: 3. a short, fat, gel filtration column?
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r**o
发帖数: 212 | 4 millipore ultrafree filter devices
60ml 的体积。我手头有10K的，不确定有没有50k大小的。你可以察看他们的产品目录
。。。 |
T**********t
发帖数: 1604 | 5 50ml基本上没法直接过gel filtration的柱子吧。体积太大了。
我觉得只能用差速离心吧。但是我自己从来没做过差速离心分蛋白，不知道能不能实现
lz的要求。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 6 我们有那个
一管只能装15ml
另外就是lysate的话会不会很快就给堵上了
我们平时用这个来concentrate purified protein
都需要离心很久很久
lysate的话不知道是不是很快就不行了
【在 r**o 的大作中提到】
: millipore ultrafree filter devices
: 60ml 的体积。我手头有10K的，不确定有没有50k大小的。你可以察看他们的产品目录
: 。。。
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T**********t
发帖数: 1604 | 7 嗯，我觉得够呛。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我们有那个
: 一管只能装15ml
: 另外就是lysate的话会不会很快就给堵上了
: 我们平时用这个来concentrate purified protein
: 都需要离心很久很久
: lysate的话不知道是不是很快就不行了
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s******y
发帖数: 28562 | 8 I remember seeing some 50mL membrane filtration units around.
They are inverted, that means the total solution is put in the bottom of the
unit, and the filtrate will flow up to the reception unit that is inserted
inside the tube.
For such setting, it won't be clogged by lysate.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我们有那个
: 一管只能装15ml
: 另外就是lysate的话会不会很快就给堵上了
: 我们平时用这个来concentrate purified protein
: 都需要离心很久很久
: lysate的话不知道是不是很快就不行了
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s******y
发帖数: 28562 | 9 OK, it's call Millipore* Centriprep* Centrifugal Filter Units
They have 30 kD cut off but can only hold 15mL sulotion.
the
inserted
【在 s******y 的大作中提到】
: I remember seeing some 50mL membrane filtration units around.
: They are inverted, that means the total solution is put in the bottom of the
: unit, and the filtrate will flow up to the reception unit that is inserted
: inside the tube.
: For such setting, it won't be clogged by lysate.
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s******y
发帖数: 28562 | 10 Do you really have to seperate them by size?
Can you use ion exchange column first to seperate them by charge?
The ion exchange column will also concentrate your protein and make the
volume smaller.
Dialysis...I don't really like to do it because it will give you a bunch of
precipitation after overnight dialysis.
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 想请教一下如果现在有细胞Lysate（破碎细胞以后9-10k rpm离心上清），
: 大量（50-100ml）
: 想按照蛋白大小快速粗分离
: 比如30kDa左右为分界
: 有没有什么好方法？
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C*******e
发帖数: 4348 | 11 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
我就是想知道有没有办法粗分一下
事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
纯化的时候GST绑在柱子上
得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
这个好像是个常见问题
好像有的可以通过额外连一段linker来解决
我就是想在不重新做construct的情况下
如果有办法可以一开始粗分一下，然后再上柱子，就方便多了
所以想的是有没有什么原始的生化方法可以粗分的
【在 s******y 的大作中提到】
: OK, it's call Millipore* Centriprep* Centrifugal Filter Units
: They have 30 kD cut off but can only hold 15mL sulotion.
:
: the
: inserted
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T**********t
发帖数: 1604 | 12 用大一点的柱子或者两根柱子串起来不就好了。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
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s******r
发帖数: 2876 | 13 能不能用硫酸铵沉淀？
重做constructs显然要容易得多。
谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
我就是想知道有没有办法粗分一下
事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
纯化的时候GST绑在柱子上
得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
这个好像是个常见问题
好像有的可以通过额外连一段linker来解决
我就是想在不重新做construct的情况下
如果有办法可以一开始粗分一下，然后再上柱子，就方便多了
所以想的是有没有什么原始的生化方法可以粗分的
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
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C*******e
发帖数: 4348 | 14 如果只有一个，做construct是容易
但我有十几个
而且就算加linker也不一定能保证这样的问题不会重现
如果有个简单的方法粗分，才是容易很多吧
毕竟条件什么都摸好了
【在 s******r 的大作中提到】
: 能不能用硫酸铵沉淀？
: 重做constructs显然要容易得多。
:
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
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m*********7
发帖数: 5207 | 15 Maybe you can filter your lysate using 0.22um filtration unit, or centrifuge
at high speed to get rid of precipitates/protein aggregates first. |
T**********t
发帖数: 1604 | 16 50ml的lysate直接过0.22um的filter的话，绝对是会堵的。我那时是用syringe拿手压
的，连换了三个filter才算搞定，累了个半死。如果用vacuum可能会容易一点吧。
centrifuge
【在 m*********7 的大作中提到】
: Maybe you can filter your lysate using 0.22um filtration unit, or centrifuge
: at high speed to get rid of precipitates/protein aggregates first.
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s******y
发帖数: 28562 | 17 try to check if there is difference in PI value between your protein and the
GST protein. If there is, then you can use ion exchange column to seperate
the GST protein and your GST-fusion protein after the glutathione-resin
pulldown.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
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C*******e
发帖数: 4348 | 18 谢谢
我现在的问题不是elute以后怎么分开两个蛋白
因为我们用PreScission Protease
我想的是最好能提高resin的利用率
现在连在resin上的大多是GST tag alone
严重影响了纯化蛋白的产率
而后续研究又要用大量的蛋白
而且最好是同一batch提的
现在想到也许可行的是ammonium sulfate ppt
the
seperate
【在 s******y 的大作中提到】
: try to check if there is difference in PI value between your protein and the
: GST protein. If there is, then you can use ion exchange column to seperate
: the GST protein and your GST-fusion protein after the glutathione-resin
: pulldown.
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s******y
发帖数: 28562 | 19 yeah, you can try to do a pilot test and see if your protein and the GST can
be differentially precipitated by different concentration of ammomiun
sulfate.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢
: 我现在的问题不是elute以后怎么分开两个蛋白
: 因为我们用PreScission Protease
: 我想的是最好能提高resin的利用率
: 现在连在resin上的大多是GST tag alone
: 严重影响了纯化蛋白的产率
: 而后续研究又要用大量的蛋白
: 而且最好是同一batch提的
: 现在想到也许可行的是ammonium sulfate ppt
:
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e****s
发帖数: 1125 | 20 你这种情况可以试试一个简单的办法
说不定Salt cut可以分出来。
按照20%, 40%, 60%, 70%的浓度递增salt cut，很可能GST和融合蛋白在不同的Salt
cut组分里。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
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C*******e
发帖数: 4348 | 21 谢谢
可能会这么做
你说的salt cut就是NH4SO4 ppt吧
【在 e****s 的大作中提到】
: 你这种情况可以试试一个简单的办法
: 说不定Salt cut可以分出来。
: 按照20%, 40%, 60%, 70%的浓度递增salt cut，很可能GST和融合蛋白在不同的Salt
: cut组分里。
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l*********s
发帖数: 5409 | 22 how about reusing GST resin?
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢
: 可能会这么做
: 你说的salt cut就是NH4SO4 ppt吧
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