c****y
发帖数: 14 | 1 请教各位大侠：
我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
谢帮助！ |
z****g
发帖数: 3340 | 2 可能2个原因：
1）high expression of your gene is toxic to cells and in long-tern culture
these cells gain growth
disadvantage against those with lower expression, and eventually will lost
expression of transgene, even
under selection pressure;
or 2) promoter silencing, especially very frequently in stem cells.
GFP
【在 c****y 的大作中提到】
: 请教各位大侠：
: 我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
: 但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
: Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
: promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
: H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
: 信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
: 到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
: 说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
: 谢帮助！
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r***e
发帖数: 2539 | 3 对于lenti vector，transfection能表达，但infection不表达的话，可能是
1. 质粒重组掉了一段序列（在Lenti载体中经常发生），影响你的蛋白表达。
2. transfection可以用external promoter，而infection以后只能用internal promot
er。
GFP
【在 c****y 的大作中提到】
: 请教各位大侠：
: 我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
: 但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
: Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
: promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
: H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
: 信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
: 到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
: 说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
: 谢帮助！
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b******n
发帖数: 4225 | 4 你做瞬时转染是什么细胞系？
H1299没有p53转录因子……
GFP
【在 c****y 的大作中提到】
: 请教各位大侠：
: 我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
: 但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
: Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
: promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
: H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
: 信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
: 到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
: 说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
: 谢帮助！
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c****y
发帖数: 14 | 5 谢谢各位的解答。我做瞬时转染的时候也是用的H1299细胞，即使没有p53转录因子还是
检测到了目标蛋白的表达。请问这跟p53有什么关系吗？谢谢！ |
s******r
发帖数: 2876 | 6 也许你的CMV promoter被甲基化了，换个promoter试试。
请教各位大侠：
我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
谢帮助！
【在 c****y 的大作中提到】
: 请教各位大侠：
: 我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
: 但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
: Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
: promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
: H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
: 信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
: 到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
: 说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
: 谢帮助！
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c****y
发帖数: 14 | 7 Hi, zgrzfg (wushi),
You think that
1) high expression of your gene is toxic to cells and in long-tern culture
these cells gain growth disadvantage against those with lower expression,
and eventually will lost expression of transgene, even under selection
pressure;
Actually I cotransfect the plasmid and Hygromycin marker plasmid into
tetracyclin-inducible HeLa cell line and got stable cell line by selection
with hygromycin. I still didn't detect protein expressed by western blot in
such stable c |
c****y
发帖数: 14 | 8 Hi, sinister (@_@),
If the CMV promoter is methylated to inhibit transcription, the protein
should be expressed after treatment with demethylation agent 5'Aza, right?
Can you suggest other good promoter for it? Thanks. |
c****y
发帖数: 14 | 9 Hi, reuse,
对于lenti vector，infection后整合到染色体上，应该还是用CMV promoter, 对吗？
因为这儿没有internal promoter.
infection后可能质粒重组掉了一段序列（在Lenti载体中经常发生），影响你的蛋白表
达。请问如何避免这种情况发生？
谢谢！ |
p****p
发帖数: 3360 | 10 我觉得你首先要检查的是你构建的目标基因有完整的结构吗？
promoter? kozak seq? ORF? polyA signal?
GFP
【在 c****y 的大作中提到】
: 请教各位大侠：
: 我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
: 但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
: Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
: promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
: H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
: 信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
: 到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
: 说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
: 谢帮助！
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c****y
发帖数: 14 | 11 我认为我构建的目标基因有完整的结构：CMV promoter, kozak seq, full ORF, and
polyA signal. 还有就是瞬时表达正常，能够看到蛋白。请问还有什么需要考虑的吗
？ |
z****g
发帖数: 3340 | 12 If you don't have special preference to make a stable in HeLa cells, just
switch to 293 cells which is much
much easy for transfection, selection and colony picking.
also you can make some extra plates and check expression of your gene after
selection at different time
points. so you may get idea how is your transgene expression along with long
-term selection.
in
line?
【在 c****y 的大作中提到】
: Hi, zgrzfg (wushi),
: You think that
: 1) high expression of your gene is toxic to cells and in long-tern culture
: these cells gain growth disadvantage against those with lower expression,
: and eventually will lost expression of transgene, even under selection
: pressure;
: Actually I cotransfect the plasmid and Hygromycin marker plasmid into
: tetracyclin-inducible HeLa cell line and got stable cell line by selection
: with hygromycin. I still didn't detect protein expressed by western blot in
: such stable c
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r***e
发帖数: 2539 | 13 lentivector 转录整个病毒RNA的promoter在5UTR 前面，内部还有自己的Promoter。
有时候内部的Promoter和你的基因配合不好，但是还可以从外部promoter表达。
一个例子就是Tet on vector，要感染才能用dox调控，转染的话，不用dox都表达，就是
从外部promoter。
【在 c****y 的大作中提到】
: 我认为我构建的目标基因有完整的结构：CMV promoter, kozak seq, full ORF, and
: polyA signal. 还有就是瞬时表达正常，能够看到蛋白。请问还有什么需要考虑的吗
: ？
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a*********7
发帖数: 342 | 14 I think it is really important to do a RT-PCR to know if the target gene is
expressed or not. During stable transfection it is quite often that part of
you target gene will not get integrated into cellular genome because this
is a purely random integration process. If you can detect the RNA
expression, you might be more confident about protein detection. If
necessary, you can even enrich the protein by IP before western blot. |
c****y
发帖数: 14 | 15 非常谢谢各位提供的信息。
请问abcd1234567，通常lentivirus整合到染色体应该是整个序列整合到染色体上，对
吗？如何避免目的基因不能整合到染色体上？谢谢！ |
a*********7
发帖数: 342 | 16 if you use lentivirus to transduce the cells and you see GFP expression,
your target gene should get integrated in the cellular genome. As others
said, maybe the promotor gets modified in the cell so that the target gene
can not be expressed well. |
