w******e
发帖数: 1187 | 1 土人第一次做，全盘follow trizol的protocol。为省reagent用了100mg tissue
per ml trizol。发现以下问题，请达人指点：
1. chloroform extraction后的precipitation，为什么用isopropanol？室温
incubate也让我很困惑。。。
2. 做了两次，第一次是heart，拿到RNA很顺利，测OD时发现：260 peak偏向270；
230附近有极高的峰。看来chloroform和precipitate后wash的步骤都不太effective？
3. 第二次做liver，搞到巨多RNA，很oily，dry了之后pellet死活不溶，试了
60oC加热，加大volume，最后还是有很多不溶。是不是trizol用少了？
4. 用了hand held homogenizer和pestle+mortar两种tissue homogenization
methods，run了urea agarose gel（顺便请问大家都用什么denaturing gel），
18S:28S rRNA大约1：1，很困惑degra |
T**********t
发帖数: 1604 | 2 别的我不知道。
不过ethanol precipitation的recovery其实在室温下比在低温下更好。温度越低，
recovery越差。很多protocol建议低温，其实是出于degradation的考虑。有可能这个
trizol kit里加了很多酶抑制剂，所以不怕degradation，就可以室温操作了。
isopropanol的沉淀效率比ethanol高，所以需要的用量比ethanol少，适合用于浓度比
较低的核酸沉淀。但是isopropanol比ethanol难挥发，真空干燥用的时间更长，得到的
pellet也不如ethanol precipitation的pellet贴壁贴得牢。
至于你的chloroform wash不够effective的问题，也有可能是你吸取aqueous phase的
时候太贪心，想尽量把上层吸干净，结果反而夹带了一点phenol进来。我经常犯这种错
误，最后不得不再做一次chloroform wash，得不偿失。。。
【在 w******e 的大作中提到】
: 土人第一次做，全盘follow trizol的protocol。为省reagent用了100mg tissue
: per ml trizol。发现以下问题，请达人指点：
: 1. chloroform extraction后的precipitation，为什么用isopropanol？室温
: incubate也让我很困惑。。。
: 2. 做了两次，第一次是heart，拿到RNA很顺利，测OD时发现：260 peak偏向270；
: 230附近有极高的峰。看来chloroform和precipitate后wash的步骤都不太effective？
: 3. 第二次做liver，搞到巨多RNA，很oily，dry了之后pellet死活不溶，试了
: 60oC加热，加大volume，最后还是有很多不溶。是不是trizol用少了？
: 4. 用了hand held homogenizer和pestle+mortar两种tissue homogenization
: methods，run了urea agarose gel（顺便请问大家都用什么denaturing gel），
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T**********t
发帖数: 1604 | 3 另外，如果你跑胶发现RNA还是有degradation的话，把isopropanol precipitation那
一步改成在冰上或者-20C下做好了，recovery的差别应该不会很显著的。 |
v***a
发帖数: 1242 | 4 我也挑我知道的说说。
liver里提取RNA我也出现相同的状况，非常难溶，一般我会根据pellet大小加多点DEPC
水，如果还是不溶，我也不管它，貌似放到-80度储存后它最终会自己溶掉的。要么我
就多vortex一下。
有个数据说1mg的tissue中，muscle或brain等大约可以得到1-1.5 ug的RNA，而liver可
以得到6-10 ug的RNA。所以巨多RNA正常。
【在 w******e 的大作中提到】
: 土人第一次做，全盘follow trizol的protocol。为省reagent用了100mg tissue
: per ml trizol。发现以下问题，请达人指点：
: 1. chloroform extraction后的precipitation，为什么用isopropanol？室温
: incubate也让我很困惑。。。
: 2. 做了两次，第一次是heart，拿到RNA很顺利，测OD时发现：260 peak偏向270；
: 230附近有极高的峰。看来chloroform和precipitate后wash的步骤都不太effective？
: 3. 第二次做liver，搞到巨多RNA，很oily，dry了之后pellet死活不溶，试了
: 60oC加热，加大volume，最后还是有很多不溶。是不是trizol用少了？
: 4. 用了hand held homogenizer和pestle+mortar两种tissue homogenization
: methods，run了urea agarose gel（顺便请问大家都用什么denaturing gel），
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f*********r
发帖数: 1233 | 5 我不直接回答你的问题，只是提供一个貌似更好的、而且可行的方案。
与其用trizol，加什么氯仿、异丙醇，最后是乙醇这么多步骤，不如用RNAzol一步完成
。pipette的时候，不用担心多吸会有下层液体的污染。因为rnazol根本没有液体分层。
不管用那种试剂，你这种从活体组织提取rna的情况，根本用不着100mg。尤其象肝脏。
有两三粒芝麻大小的组织就完全可以了。当然，还是用1ml试剂比较稳妥。
另外，在加异丙醇（或者别的醇）沉淀rna的时候，不一定按照说明那样离心。可以采
取小一些转速。这样出来的pellet比较松。用酒精洗就会洗得干净。最后溶解的时候也
更容易。不用担心低转速会导致低收获量。你有足够的样品，不存在收获量低的问题。
只要动作快，不用担心常温、低温。比如用rnazol，从匀浆化到形成rna沉淀pellet，
不超过20分钟。从头至尾都有保护：试剂可以保护溶解状态rna不受降解，沉淀状态的
rna也不容易降解。
为了提高匀浆化效率，可采用sonication。10秒钟可以完全打散任何组织。 |
w******e
发帖数: 1187 | 6 非常感谢几位的回复！我去试试看，有好结果再上来报告：）
层。
【在 f*********r 的大作中提到】
: 我不直接回答你的问题，只是提供一个貌似更好的、而且可行的方案。
: 与其用trizol，加什么氯仿、异丙醇，最后是乙醇这么多步骤，不如用RNAzol一步完成
: 。pipette的时候，不用担心多吸会有下层液体的污染。因为rnazol根本没有液体分层。
: 不管用那种试剂，你这种从活体组织提取rna的情况，根本用不着100mg。尤其象肝脏。
: 有两三粒芝麻大小的组织就完全可以了。当然，还是用1ml试剂比较稳妥。
: 另外，在加异丙醇（或者别的醇）沉淀rna的时候，不一定按照说明那样离心。可以采
: 取小一些转速。这样出来的pellet比较松。用酒精洗就会洗得干净。最后溶解的时候也
: 更容易。不用担心低转速会导致低收获量。你有足够的样品，不存在收获量低的问题。
: 只要动作快，不用担心常温、低温。比如用rnazol，从匀浆化到形成rna沉淀pellet，
: 不超过20分钟。从头至尾都有保护：试剂可以保护溶解状态rna不受降解，沉淀状态的
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v***a
发帖数: 1242 | 7 RNAzol是不是一个很新的产品？搜了一下，好像是一个叫MBC的公司有，以前没听说过
啊。
层。
【在 f*********r 的大作中提到】
: 我不直接回答你的问题，只是提供一个貌似更好的、而且可行的方案。
: 与其用trizol，加什么氯仿、异丙醇，最后是乙醇这么多步骤，不如用RNAzol一步完成
: 。pipette的时候，不用担心多吸会有下层液体的污染。因为rnazol根本没有液体分层。
: 不管用那种试剂，你这种从活体组织提取rna的情况，根本用不着100mg。尤其象肝脏。
: 有两三粒芝麻大小的组织就完全可以了。当然，还是用1ml试剂比较稳妥。
: 另外，在加异丙醇（或者别的醇）沉淀rna的时候，不一定按照说明那样离心。可以采
: 取小一些转速。这样出来的pellet比较松。用酒精洗就会洗得干净。最后溶解的时候也
: 更容易。不用担心低转速会导致低收获量。你有足够的样品，不存在收获量低的问题。
: 只要动作快，不用担心常温、低温。比如用rnazol，从匀浆化到形成rna沉淀pellet，
: 不超过20分钟。从头至尾都有保护：试剂可以保护溶解状态rna不受降解，沉淀状态的
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C*****h
发帖数: 926 | 8 为什么不用Qiagen的RNeasy Kit?
过一下柱子，就是很纯的RNA。
不需要extraction，也不需要precipitation
【在 w******e 的大作中提到】
: 土人第一次做，全盘follow trizol的protocol。为省reagent用了100mg tissue
: per ml trizol。发现以下问题，请达人指点：
: 1. chloroform extraction后的precipitation，为什么用isopropanol？室温
: incubate也让我很困惑。。。
: 2. 做了两次，第一次是heart，拿到RNA很顺利，测OD时发现：260 peak偏向270；
: 230附近有极高的峰。看来chloroform和precipitate后wash的步骤都不太effective？
: 3. 第二次做liver，搞到巨多RNA，很oily，dry了之后pellet死活不溶，试了
: 60oC加热，加大volume，最后还是有很多不溶。是不是trizol用少了？
: 4. 用了hand held homogenizer和pestle+mortar两种tissue homogenization
: methods，run了urea agarose gel（顺便请问大家都用什么denaturing gel），
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w******e
发帖数: 1187 | 9 I'm doing aptamers, which are quite small unfortunately:(
【在 C*****h 的大作中提到】
: 为什么不用Qiagen的RNeasy Kit?
: 过一下柱子，就是很纯的RNA。
: 不需要extraction，也不需要precipitation
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f*********r
发帖数: 1233 | 10 对，我是今年才开始用的。因为以前一直用他们trizol，所以他们经常给我们发新产品
广告和免费试用小包装。试了一下，很好用。对于大规模处理样品，每次几十上百个样
品，这个试剂非常实用。好处如下：
1）一步完成，简便快捷。
2）对样品要求不高，适用范围广。rna质量有保证，比trizol只高不低。从大块组织到
少量细胞，都行。不象过柱，纯是纯，但是对浓度、液体量等都限制很严。
3）跟trizol兼容。
4）不贵
5）对实验人员的技巧要求甚低。
【在 v***a 的大作中提到】
: RNAzol是不是一个很新的产品？搜了一下，好像是一个叫MBC的公司有，以前没听说过
: 啊。
:
: 层。
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v***a
发帖数: 1242 | 11 谢谢！呵呵，查了一下，果然还要便宜点。比如100 mg tissue 消耗 1 ml TRIzol/
RNAzol，100 ml的TRIzol卖 $ 145，而100 ml的RNAzol卖 $ 134.
【在 f*********r 的大作中提到】
: 对，我是今年才开始用的。因为以前一直用他们trizol，所以他们经常给我们发新产品
: 广告和免费试用小包装。试了一下，很好用。对于大规模处理样品，每次几十上百个样
: 品，这个试剂非常实用。好处如下：
: 1）一步完成，简便快捷。
: 2）对样品要求不高，适用范围广。rna质量有保证，比trizol只高不低。从大块组织到
: 少量细胞，都行。不象过柱，纯是纯，但是对浓度、液体量等都限制很严。
: 3）跟trizol兼容。
: 4）不贵
: 5）对实验人员的技巧要求甚低。
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j*****a
发帖数: 658 | 12 no, you still have to do precipitation to purify your RNA.
【在 C*****h 的大作中提到】
: 为什么不用Qiagen的RNeasy Kit?
: 过一下柱子，就是很纯的RNA。
: 不需要extraction，也不需要precipitation
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y****m
发帖数: 37 | 13 I recommend you to read Cold Spring Harb Protocol by Rio DC, Ares M Jr,
Hannon GJ, Nilsen TW.
1. less volumn required
2. after isopropanol precipitation, there are normally still lots of crap in
sample. I normally use water plus 0.25% SDS to dissolve pellet, then phenol
extract again, Ethenal precipitate the sample.
3. completely dried RNA is normally very hard to disovle, try to avoid that.
4. after sanp freeze, before thraw in trizol, you could grind it with liquid
N2 first, then disolve with
【在 w******e 的大作中提到】
: 土人第一次做，全盘follow trizol的protocol。为省reagent用了100mg tissue
: per ml trizol。发现以下问题，请达人指点：
: 1. chloroform extraction后的precipitation，为什么用isopropanol？室温
: incubate也让我很困惑。。。
: 2. 做了两次，第一次是heart，拿到RNA很顺利，测OD时发现：260 peak偏向270；
: 230附近有极高的峰。看来chloroform和precipitate后wash的步骤都不太effective？
: 3. 第二次做liver，搞到巨多RNA，很oily，dry了之后pellet死活不溶，试了
: 60oC加热，加大volume，最后还是有很多不溶。是不是trizol用少了？
: 4. 用了hand held homogenizer和pestle+mortar两种tissue homogenization
: methods，run了urea agarose gel（顺便请问大家都用什么denaturing gel），
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w******e
发帖数: 1187 | 14 感谢推荐！买了200ml，期待ing~
【在 f*********r 的大作中提到】
: 对，我是今年才开始用的。因为以前一直用他们trizol，所以他们经常给我们发新产品
: 广告和免费试用小包装。试了一下，很好用。对于大规模处理样品，每次几十上百个样
: 品，这个试剂非常实用。好处如下：
: 1）一步完成，简便快捷。
: 2）对样品要求不高，适用范围广。rna质量有保证，比trizol只高不低。从大块组织到
: 少量细胞，都行。不象过柱，纯是纯，但是对浓度、液体量等都限制很严。
: 3）跟trizol兼容。
: 4）不贵
: 5）对实验人员的技巧要求甚低。
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