i********e 发帖数: 50 | 1 有个超大蛋白,单体为550Kda, 细胞里是tetramer。想看一下转基因表达后的状态,是
monomer/dimer/tetramer.请问除了native page还有什么方法能够鉴别或者比较
monomer/tetramer?
native page用了basic-native gel protocol。做western blot的话,使用的抗体和
monomer或tetramer结合的效果会有差异吗?比如monomer的结合效果好,band清晰。抗
体和tetramer 反应弱,看不大出来band?
比较奇怪的是,6%的胶跑3个小时和6个小时的结果不一样。难道6个小时后所有的蛋白
跑出去了?不应该啊.
求高人指点。 |
a****k 发帖数: 1130 | 2 可以run gel filtration column
【在 i********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有个超大蛋白,单体为550Kda, 细胞里是tetramer。想看一下转基因表达后的状态,是 : monomer/dimer/tetramer.请问除了native page还有什么方法能够鉴别或者比较 : monomer/tetramer? : native page用了basic-native gel protocol。做western blot的话,使用的抗体和 : monomer或tetramer结合的效果会有差异吗?比如monomer的结合效果好,band清晰。抗 : 体和tetramer 反应弱,看不大出来band? : 比较奇怪的是,6%的胶跑3个小时和6个小时的结果不一样。难道6个小时后所有的蛋白 : 跑出去了?不应该啊. : 求高人指点。
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C*******e 发帖数: 4348 | 3 抗体结合不好说
因为抗体生成的时候用的是变性蛋白
识别的区域未必暴露在表面 |
T**********t 发帖数: 1604 | 4 Analytical Ultracentrifugation可以判断monomer/oligomer状态,但是需要的蛋白量
比较大。一个样品体积要大概400ul,absorbance最好在1左右,而且做完基本就废了,
拿不回来了。 |
m**z 发帖数: 787 | 5 that's not an easy experiment...
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Analytical Ultracentrifugation可以判断monomer/oligomer状态,但是需要的蛋白量 : 比较大。一个样品体积要大概400ul,absorbance最好在1左右,而且做完基本就废了, : 拿不回来了。
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T**********t 发帖数: 1604 | 6 主要是仪器比较delicate吧,容易坏。所以帮我做AUC的那个实验室是有专人负责跑AUC
的,别人只管提供样品,不能插手仪器操作。就这样那仪器还三天两头坏掉。。。
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : that's not an easy experiment...
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m**z 发帖数: 787 | 7 对样品的要求也很高,比如纯度,稳定性什么的,因为一转就是十几个小时(velocity)
甚至两三天的(equilibrium).数据处理也不容易.不过对于oligomerization方面的问
题的确是best experiment to do, just not easy...
AUC
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 主要是仪器比较delicate吧,容易坏。所以帮我做AUC的那个实验室是有专人负责跑AUC : 的,别人只管提供样品,不能插手仪器操作。就这样那仪器还三天两头坏掉。。。
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i********e 发帖数: 50 | 8
gel filtration出来的fraction还是需要别的方法来鉴定。原本是想native page的结
果比较可靠后用来检测gel filtration的fractions的。光从分光度来判断
gel filtration的fraction比较困难。1,蛋白质量少,很难有peak。2,单体蛋白就
550Kda,直接从bed volume就跑出来了。很怀疑跟4倍体能有retention time 上的显著
差异。
【在 a****k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 可以run gel filtration column
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m**z 发帖数: 787 | 9 蛋白量倒是不用担心,这么大的蛋白用A220 backbone absorbance应该只要一点点蛋白
。不过对于一般的gel filtration column来讲,的确太大了
【在 i********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : gel filtration出来的fraction还是需要别的方法来鉴定。原本是想native page的结 : 果比较可靠后用来检测gel filtration的fractions的。光从分光度来判断 : gel filtration的fraction比较困难。1,蛋白质量少,很难有peak。2,单体蛋白就 : 550Kda,直接从bed volume就跑出来了。很怀疑跟4倍体能有retention time 上的显著 : 差异。
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T**********t 发帖数: 1604 | 10 FPLC看A220 absorbance还要换lamp和filter吧?反正我的FPLC只能看254和280。为了
看这一个蛋白的aggregation买一套lamp+filter,还挺费钱的。。。
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 蛋白量倒是不用担心,这么大的蛋白用A220 backbone absorbance应该只要一点点蛋白 : 。不过对于一般的gel filtration column来讲,的确太大了
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m**z 发帖数: 787 | 11 ok... 那么大的蛋白,里面trp/tyr应该不少把,也许A280也够了。或者bradford
assay on each fraction, could be done on a microtiter plate and a plate
reader。这个方法也是很灵敏的
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : FPLC看A220 absorbance还要换lamp和filter吧?反正我的FPLC只能看254和280。为了 : 看这一个蛋白的aggregation买一套lamp+filter,还挺费钱的。。。
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a****k 发帖数: 1130 | 12 你不是有抗体的吗,gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这
方面的实验,是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void
position出来的,monomer和tetramer肯定是可以分开的
【在 i********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : gel filtration出来的fraction还是需要别的方法来鉴定。原本是想native page的结 : 果比较可靠后用来检测gel filtration的fractions的。光从分光度来判断 : gel filtration的fraction比较困难。1,蛋白质量少,很难有peak。2,单体蛋白就 : 550Kda,直接从bed volume就跑出来了。很怀疑跟4倍体能有retention time 上的显著 : 差异。
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l**n 发帖数: 109 | 13 或者把蛋白构建成GFP fusion,用荧光检测。
【在 a****k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你不是有抗体的吗,gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这 : 方面的实验,是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void : position出来的,monomer和tetramer肯定是可以分开的
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y****m 发帖数: 37 | 14
glycerol gradient, then western? blue native gel electrophorensis?
did you change to fresh buffer after a while? most likely the running buffer
went bad.
【在 i********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有个超大蛋白,单体为550Kda, 细胞里是tetramer。想看一下转基因表达后的状态,是 : monomer/dimer/tetramer.请问除了native page还有什么方法能够鉴别或者比较 : monomer/tetramer? : native page用了basic-native gel protocol。做western blot的话,使用的抗体和 : monomer或tetramer结合的效果会有差异吗?比如monomer的结合效果好,band清晰。抗 : 体和tetramer 反应弱,看不大出来band? : 比较奇怪的是,6%的胶跑3个小时和6个小时的结果不一样。难道6个小时后所有的蛋白 : 跑出去了?不应该啊. : 求高人指点。
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i********e 发帖数: 50 | 15
有抗体,western 没问题。问题是要鉴别是monomer还是tetramer.SDS-PAGE是变性蛋白
,出来的都是monomer了。实验目的是确定蛋白的状态,目前只想到native page 和gel
filtration.
谢谢你关于柱子的建议,打算试一下。可是出来的fraction还是需要别的方法来确定到
底是monomer或tetramer吧。就算出来2个peak,怎么能说是2种不同状态呢?
【在 a****k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你不是有抗体的吗,gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这 : 方面的实验,是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void : position出来的,monomer和tetramer肯定是可以分开的
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i********e 发帖数: 50 | 16
谢谢。glycerol gradient要很多蛋白量才可以吧?blue native gel electropheresis
是什么?
buffer
这个的确不知道。非常感谢!不过很困惑,buffer为什么会went bad? PH的改变?
【在 y****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : glycerol gradient, then western? blue native gel electrophorensis? : did you change to fresh buffer after a while? most likely the running buffer : went bad.
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i********e 发帖数: 50 | 17 请问上面的高人,dynamic light scattering 可行吗?以前做过一点,原理不懂。但
材料可以回收,就是用量比较大,而且要纯化蛋白。
请哪位能给科普一下? |
m**z 发帖数: 787 | 18 yes. you need purified proteins for that. it basically gives you the info of
the size of the particle. you don't need a lot, maybe 10uM of several
hundred ul. I believe it can be recycled though.
【在 i********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请问上面的高人,dynamic light scattering 可行吗?以前做过一点,原理不懂。但 : 材料可以回收,就是用量比较大,而且要纯化蛋白。 : 请哪位能给科普一下?
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i********e 发帖数: 50 | 19
of
非常感谢!请问DLS跟CD是一回事吗?我有未知的纯化样品和已知tetramer的纯化样品
,以前跟老板提过用DLS来做,结果被否决了。他说CD didn't work.我对光学原理真是
一窍不通。DLS是CD?
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : yes. you need purified proteins for that. it basically gives you the info of : the size of the particle. you don't need a lot, maybe 10uM of several : hundred ul. I believe it can be recycled though.
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m**z 发帖数: 787 | 20 totally different. CD stands for circular dichroism. It is used to monitor
the secondary structure of a protein. I suggest in your case, try gel
filtration chromatography first. Or native gel. These are probably the
easiest to do.
【在 i********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : of : 非常感谢!请问DLS跟CD是一回事吗?我有未知的纯化样品和已知tetramer的纯化样品 : ,以前跟老板提过用DLS来做,结果被否决了。他说CD didn't work.我对光学原理真是 : 一窍不通。DLS是CD?
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i********e 发帖数: 50 | 21 thank you very much!
看来还是得先解决native page。问题又转回来了。 |
m**z 发帖数: 787 | 22 Gel filtration also worth a try. It may be easier if you have the right
column and can separate the monomer/tetramer.
【在 i********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : thank you very much! : 看来还是得先解决native page。问题又转回来了。
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a****k 发帖数: 1130 | 23 就是说,你拿自己的sample run一个gel filtration column,collect每一个faction,然后用这些fraction做western blot (注:这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根本就不重要,你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面)。gel filtration的每个fraction根据和standard蛋白位置的比较,是可以知道大概的size的,那不就知道你的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda,到时候不就知道是monomer还是tetramer了吗
gel
【在 i********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : thank you very much! : 看来还是得先解决native page。问题又转回来了。
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i********e 发帖数: 50 | 24
faction,然后用这些fraction做western blot (注:这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根
本就不重要,你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面)。gel filtration的每
个fraction根据和standard蛋白位置的比较,是可以知道大概的size的,那不就知道你
的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda,到时候不就知道是monomer还是
tetramer了吗
我们的tetramer就是用gel filtration 分离纯化出来的,western 的结果也没问题。
现在怀疑monomer的存在。SDS-PAGE的话,假如原本是tetramer的蛋白也会变性成
monomer跑出来。这样就不知道原来fraction里的究竟是tetramer还是mononer.这就是
我为什么想用native-page的原因。monomer就有550Kda,一般gel filtration用的
standard 蛋白没有那么大的。最理想的结果是tetrmer在void volume,monomer不是。
用什么柱子能使2者的re
【在 a****k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 就是说,你拿自己的sample run一个gel filtration column,collect每一个faction,然后用这些fraction做western blot (注:这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根本就不重要,你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面)。gel filtration的每个fraction根据和standard蛋白位置的比较,是可以知道大概的size的,那不就知道你的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda,到时候不就知道是monomer还是tetramer了吗 : : gel
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a****k 发帖数: 1130 | 25 superose 6上面650KDa的standard蛋白和void还是有相当的距离的。不知道你当时用的
是什么gel filtration column?还有,load的sample volume,elute的speed也会有影响
【在 i********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : faction,然后用这些fraction做western blot (注:这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根 : 本就不重要,你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面)。gel filtration的每 : 个fraction根据和standard蛋白位置的比较,是可以知道大概的size的,那不就知道你 : 的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda,到时候不就知道是monomer还是 : tetramer了吗 : 我们的tetramer就是用gel filtration 分离纯化出来的,western 的结果也没问题。 : 现在怀疑monomer的存在。SDS-PAGE的话,假如原本是tetramer的蛋白也会变性成 : monomer跑出来。这样就不知道原来fraction里的究竟是tetramer还是mononer.这就是 : 我为什么想用native-page的原因。monomer就有550Kda,一般gel filtration用的
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n********k 发帖数: 2818 | 26 maybe I shall go to ask you to do me a favor on my problem a couple of
months later...
影响
【在 a****k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : superose 6上面650KDa的standard蛋白和void还是有相当的距离的。不知道你当时用的 : 是什么gel filtration column?还有,load的sample volume,elute的speed也会有影响
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a****k 发帖数: 1130 | 27 a couple of months later...嗯,随时欢迎,希望帮得上忙
【在 n********k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : maybe I shall go to ask you to do me a favor on my problem a couple of : months later... : : 影响
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