w******e 发帖数: 1187 | 1 想用random primer做tissue RNA的RT,然后用GAPDH specific primers做qPCR as QC;
同时用aptamer specific primers做RT和qPCR。可以在RT这一步把两种primer放在
一个reaction里做吗?有什么可能的问题?
非常感谢! |
c*********r 发帖数: 1312 | |
c******r 发帖数: 3778 | 3 这个很简单,仔细想想就明白了。
当然不可以。random primer不能用来做qPCR。原因是这个是random的,所以对各个RNA
的RT efficiency是不一样的,所以以后的qPCR都没意义了。
如果要qPCR可以用polyA或者target specific primers。但是也不能混用。原因是
polyA会RT,而你的specific primers也可以RT,结果是你的target被polyA和specific
primers分别RT,而QC只被polyA RT。但是poly A和specific primer的RT efficiency
是不一样的,所以二者不再可比。
所以只能要么用poly A,要么target和control都用specific primers。
btw,gapdh的做RT是有kit的,买一个就可以了吧?
QC;
【在 w******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想用random primer做tissue RNA的RT,然后用GAPDH specific primers做qPCR as QC; : 同时用aptamer specific primers做RT和qPCR。可以在RT这一步把两种primer放在 : 一个reaction里做吗?有什么可能的问题? : 非常感谢!
|
h********n 发帖数: 4079 | 4 你是否在实验上验证过你说的"random primer不能用来做qPCR"?
RNA
specific
efficiency
【在 c******r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个很简单,仔细想想就明白了。 : 当然不可以。random primer不能用来做qPCR。原因是这个是random的,所以对各个RNA : 的RT efficiency是不一样的,所以以后的qPCR都没意义了。 : 如果要qPCR可以用polyA或者target specific primers。但是也不能混用。原因是 : polyA会RT,而你的specific primers也可以RT,结果是你的target被polyA和specific : primers分别RT,而QC只被polyA RT。但是poly A和specific primer的RT efficiency : 是不一样的,所以二者不再可比。 : 所以只能要么用poly A,要么target和control都用specific primers。 : btw,gapdh的做RT是有kit的,买一个就可以了吧? :
|
c******r 发帖数: 3778 | 5 一针见血,确实没有。。。
不过我也懒得去验证这个,浪费时间啊。
因为验证结果很难generalize,而且需要很多的controls。即使这样,这一次好用,不
一定下一次换了primer仍然好用,仍然要花大量时间去validate,不值得啊。
还不如直接specific primers,一次搞定。
【在 h********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你是否在实验上验证过你说的"random primer不能用来做qPCR"? : : RNA : specific : efficiency
|
a****o 发帖数: 1786 | 6 我验证过
扩增效率太低,或者说斜率低,不建议使用
【在 h********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你是否在实验上验证过你说的"random primer不能用来做qPCR"? : : RNA : specific : efficiency
|
a****o 发帖数: 1786 | 7 No problem of multiple primers during reverse transcription step. in qPCR,
one primer pair unless it is radioactive labeled, resolved on gel later.
QC;
【在 w******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想用random primer做tissue RNA的RT,然后用GAPDH specific primers做qPCR as QC; : 同时用aptamer specific primers做RT和qPCR。可以在RT这一步把两种primer放在 : 一个reaction里做吗?有什么可能的问题? : 非常感谢!
|
c******r 发帖数: 3778 | 8 是,实际上target specific的primer可以run两三对都没问题。
qPCR为啥不能用multiple target specific primers?只要label不同颜色就可以啊?
SYBR当然是不行的,但是TaqMan是可以的哈
【在 a****o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : No problem of multiple primers during reverse transcription step. in qPCR, : one primer pair unless it is radioactive labeled, resolved on gel later. : : QC;
|
h********n 发帖数: 4079 | 9 比如你测某几个gene, 用random primer和poly-T primer然后qPCR得到的结果不一样(
against housekeeping gene)?
能不能详细说说?
【在 a****o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我验证过 : 扩增效率太低,或者说斜率低,不建议使用
|
c*********r 发帖数: 1312 | 10 那如果只是做用cDNA做半定量的PCR,然后跑胶看基因表达还是不表达,最多粗略估计
一下表达量高还是低,能把两对引物放一起吗? |
|
|
h****g 发帖数: 439 | 11 我现在都是用random primer做RT,然后做QPCR,内参挺准的啊
难道我所有的结果都不可信? |
c******r 发帖数: 3778 | 12 两对specific的primers,三对都可能可以。
不行的是random,poly-A,specific的primer混用。我确实没这么干过,只是觉得有问
题,所以没啥实际经验。
【在 c*********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那如果只是做用cDNA做半定量的PCR,然后跑胶看基因表达还是不表达,最多粗略估计 : 一下表达量高还是低,能把两对引物放一起吗?
|
p******d 发帖数: 3737 | 13 这个真的弄糊涂我了,我同意你说random primer对各个RNA的efficiency是不一样的,
可是能保
证GOI和house keeping gene的specific primer就有同样的efficiency吗?序列不同,
efficiency不一样很正常啊,只要是比较的是同样条件下实验组和对照组的差别就可以
了吧?就算
random primer对GOI和house keeping gene的效率不同,最后要比较的还是实验组和对
照组的相
对差别啊。
RNA
specific
efficiency
【在 c******r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个很简单,仔细想想就明白了。 : 当然不可以。random primer不能用来做qPCR。原因是这个是random的,所以对各个RNA : 的RT efficiency是不一样的,所以以后的qPCR都没意义了。 : 如果要qPCR可以用polyA或者target specific primers。但是也不能混用。原因是 : polyA会RT,而你的specific primers也可以RT,结果是你的target被polyA和specific : primers分别RT,而QC只被polyA RT。但是poly A和specific primer的RT efficiency : 是不一样的,所以二者不再可比。 : 所以只能要么用poly A,要么target和control都用specific primers。 : btw,gapdh的做RT是有kit的,买一个就可以了吧? :
|
m**********2 发帖数: 6568 | 14 我做过8个基因的。用基因specific reverse primers RT,稍微上游一点,一对儿一对
儿的做
real time qPCR。效果不错。
【在 c******r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 是,实际上target specific的primer可以run两三对都没问题。 : qPCR为啥不能用multiple target specific primers?只要label不同颜色就可以啊? : SYBR当然是不行的,但是TaqMan是可以的哈
|
f*********r 发帖数: 1233 | 15 当然可信。前提是,做逆转录的时候,模板mRNA一定不要过量。甚至可以有意识地少放
一点。这样的话,RT之后,基本可以保证所有模板都被逆转录,形成相等量dscDNA。要
的就是这种完全没有特异性的1:1的RT。
那一个样品做上n次,就可以看出,每次RT的效果是恒定的。
【在 h****g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我现在都是用random primer做RT,然后做QPCR,内参挺准的啊 : 难道我所有的结果都不可信?
|