z**********8
发帖数: 766 | 1 从cDNA中PCR一个基因，然后直接用PCR产物测序，发现前后几次的测序结果不一致，请
问为什么？难道是因为cDNA是混合物，导致每次PCR的被扩增模版不同所造成？呼唤遗
传高手！谢谢！ |
X***n
发帖数: 366 | 2 cDNA当然是混合物，同一基因还有不同splicing形式呢。所以应该跑gel, cut the gel
then cloning and sequencing. |
z**********8
发帖数: 766 | 3 抱歉我没说清我的问题。
我想看此基因有无突变，所以从不同病人样本中抽取RNA，然后从cDNA上直接扩增，得
到PCR产物后直接测序，并无克隆过程。
我的困境是，当从同一样本的cDNA上重新PCR送测序，发现结果不一致，于是郁闷了。
谢谢！ |
m*********7
发帖数: 606 | 4 2楼说的没错，你首先确定了你的PCR是单一产物（跑胶一条带）了吗？扩增的片段大小
和理论值一致吗？几次PCR所得到的产物片段大小相同吗？如果扩增产物是混合物，或
几次PCR产物组成不一样，测序结果当然会不一致。 |
y******8
发帖数: 1764 | 5 除非提供更多的步骤细节，否则没法帮你
【在 z**********8 的大作中提到】
: 从cDNA中PCR一个基因，然后直接用PCR产物测序，发现前后几次的测序结果不一致，请
: 问为什么？难道是因为cDNA是混合物，导致每次PCR的被扩增模版不同所造成？呼唤遗
: 传高手！谢谢！
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g******1
发帖数: 244 | |
c******r
发帖数: 3778 | 7 什么不同？是几个base pairs的不同？还是完全不同？总是几个不同？还是每次都不同
？ls说了，要细节。
可能的原因：
1. PCR不够specific，压根就不是你要的东西。解决方法：从新design primers。
2. ls说的，有不同的splicing form。解决方法：从新design splicing specific的
primers。
3. 还有可能你这个测试的sample有污染，比如说如果你测肿瘤细胞，由于genomic
instability，可能会有几个不同的改变，并且混有正常细胞，造成测序不准。
这是个技术问题，根遗传关系不大。 |
z**********8
发帖数: 766 | 8 感谢各位热心！
PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
谢谢！ |
s******s
发帖数: 13035 | 9 你的细胞也不是clone, 测序也测得不是clone，还有啥jjww的。
先clone了你的片段再测序
吗？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 感谢各位热心！
: PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
: 不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
: 个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
: 样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
: 我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
: 胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
: 谢谢！
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y******8
发帖数: 1764 | 10 Did you check the raw files from sequencer? Or you just read the FASTA
results.
吗？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 感谢各位热心！
: PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
: 不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
: 个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
: 样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
: 我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
: 胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
: 谢谢！
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c******r
发帖数: 3778 | 11 ok，如果3有可能，那可能是因为你的sample里面混了很多不同来源的DNA，有正常的，
有肿瘤的，不同阶段的肿瘤的。
你说的同一个样本是指同一个tissue提了三次，还是提好的同一个PCR sample测了三次？
由于各种DNA之间的amplification efficiency差不多，所以有可能这次这个dominant
，下次那个dominant。
解决办法就是楼上说的，clone出来，把每个sample取几个不同的clone分别去
sequencing。
我是瞎猜的，是不是这样，需要实验证实。
吗？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 感谢各位热心！
: PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
: 不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
: 个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
: 样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
: 我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
: 胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
: 谢谢！
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z**********8
发帖数: 766 | 12 再次谢谢各位！也呼唤做过这方面的兄弟出来！
我做这个之前请教过做这方面的遗传牛人，一般测序病人样本是不需要做克隆的。因为
工作量太大。
关于测序结果，我只有FASTA results.没有running gel的raw data。
这些都不是问题，所以我想请教遗传大牛，一般只有搞突变这方面的才更有经验。
我用的样本是经过抗体瓷珠selected cells，不是tissue。
同一样本是指从一个病人的这些selected cells中提的RNA后RT所得的cDNA，三次PCR指
从同一管cDNA先后进行PCR，然后去测序。不是三次RT。 |
O******e
发帖数: 4845 | 13 你得首先确认你做的实验，在技术上没有出现问题。比如说这个PCR，你是用的什么
酶？普通的Taq还是其它的？你的PCR产物到底有多大？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 再次谢谢各位！也呼唤做过这方面的兄弟出来！
: 我做这个之前请教过做这方面的遗传牛人，一般测序病人样本是不需要做克隆的。因为
: 工作量太大。
: 关于测序结果，我只有FASTA results.没有running gel的raw data。
: 这些都不是问题，所以我想请教遗传大牛，一般只有搞突变这方面的才更有经验。
: 我用的样本是经过抗体瓷珠selected cells，不是tissue。
: 同一样本是指从一个病人的这些selected cells中提的RNA后RT所得的cDNA，三次PCR指
: 从同一管cDNA先后进行PCR，然后去测序。不是三次RT。
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z**********8
发帖数: 766 | 14 PCR用的是invitrogen的blue mix，应该是普通的。
大小约1kb。
请问同一肿瘤病人的同一类细胞是否可以同时发生多个突变？即这个人有些细胞这个bp
突变，有些那个bp突变。可能吗？我觉得这是遗传问题。
【在 O******e 的大作中提到】
: 你得首先确认你做的实验，在技术上没有出现问题。比如说这个PCR，你是用的什么
: 酶？普通的Taq还是其它的？你的PCR产物到底有多大？
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a***e
发帖数: 1010 | 15 generally speaking, if your tumor samples come from microdisection,they are
supposed to be a clone and should not contain variations in the same
microdisected sample.
In your case, a regular Taq enzyme can generate several point mutations
during PCR, if the product size is around 1kb.
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: PCR用的是invitrogen的blue mix，应该是普通的。
: 大小约1kb。
: 请问同一肿瘤病人的同一类细胞是否可以同时发生多个突变？即这个人有些细胞这个bp
: 突变，有些那个bp突变。可能吗？我觉得这是遗传问题。
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n********k
发帖数: 2818 | 16 No offense....after reading all the replies and ur responses, I would highly
recommend you do some very basic homework before you would come to an
opinion/conclusion about what you might be dealing with...seriously, it
likely will save you tons of times and money...I strongly expect you are
pretty much a greenhand in this field, don't really have a clue what you
might be dealing with.
That said, forget what I said if you are a very experienced one BUT do
reiterate what your questions/problems are in an understandable way...
【在 z**********8 的大作中提到】
: 从cDNA中PCR一个基因，然后直接用PCR产物测序，发现前后几次的测序结果不一致，请
: 问为什么？难道是因为cDNA是混合物，导致每次PCR的被扩增模版不同所造成？呼唤遗
: 传高手！谢谢！
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O******e
发帖数: 4845 | 17 ahche已经说过了，你得首先确认你的PCR-PCR过程中没有引入突变，其次才应该考虑
遗传学上的那些“大问题”。
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: PCR用的是invitrogen的blue mix，应该是普通的。
: 大小约1kb。
: 请问同一肿瘤病人的同一类细胞是否可以同时发生多个突变？即这个人有些细胞这个bp
: 突变，有些那个bp突变。可能吗？我觉得这是遗传问题。
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z**********8
发帖数: 766 | 18 谢谢各位参与讨论!
我用我浅薄的遗传学知识为大家解释一下突变的问题.
大家说的PCR致突变大都是指做克隆时发生的点突变,做克隆时PCR酶可以导致点突变,连
接后单克隆挑出再提质粒后再测序,如果有突变,大多是这种情况.
寻找病人的基因突变不是这样的,因为每个病人做克隆是不现实的,而且很多突变不是纯
合,杂合突变如果去做克隆,没法选择挑几个克隆才合理或有可能的得到那个突变.所以
筛选病人突变时,不能用克隆的方法,而多用PCR产物直接测序,或者为了更省钱,设计好
PCR再酶切的方法去筛.
我因为是用PCR产物直接测序,这是个混合物,即时有些bp突变,不可能所有片段的那个bp
都突变,所以这就保证只有真正的突变才能被测序出来.因此,质疑PCR的朋友请不必再回
帖了.
回到问题,我有些奇怪的猜测,希望遗传朋友或懂测序的朋友指点.
1)有无可能有些肿瘤细胞出现三倍体? 有些细胞仍正常.
2)若突变细胞只是所有细胞一部分,会否导致缺失突变被测序时,两条链高低不等? 可相
差几倍吗? 一般的概念是等峰,我有些突变是这样.可还有些总是测序FASTA峰值差很多.
是否是因为突变的细胞比例低所致?
谢谢! |
a***e
发帖数: 1010 | 19 the problem here is that you can't repeat your data ! That has to be an
error in the experiment.
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: 谢谢各位参与讨论!
: 我用我浅薄的遗传学知识为大家解释一下突变的问题.
: 大家说的PCR致突变大都是指做克隆时发生的点突变,做克隆时PCR酶可以导致点突变,连
: 接后单克隆挑出再提质粒后再测序,如果有突变,大多是这种情况.
: 寻找病人的基因突变不是这样的,因为每个病人做克隆是不现实的,而且很多突变不是纯
: 合,杂合突变如果去做克隆,没法选择挑几个克隆才合理或有可能的得到那个突变.所以
: 筛选病人突变时,不能用克隆的方法,而多用PCR产物直接测序,或者为了更省钱,设计好
: PCR再酶切的方法去筛.
: 我因为是用PCR产物直接测序,这是个混合物,即时有些bp突变,不可能所有片段的那个bp
: 都突变,所以这就保证只有真正的突变才能被测序出来.因此,质疑PCR的朋友请不必再回
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O******e
发帖数: 4845 | 20 you really really missed the points
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: 谢谢各位参与讨论!
: 我用我浅薄的遗传学知识为大家解释一下突变的问题.
: 大家说的PCR致突变大都是指做克隆时发生的点突变,做克隆时PCR酶可以导致点突变,连
: 接后单克隆挑出再提质粒后再测序,如果有突变,大多是这种情况.
: 寻找病人的基因突变不是这样的,因为每个病人做克隆是不现实的,而且很多突变不是纯
: 合,杂合突变如果去做克隆,没法选择挑几个克隆才合理或有可能的得到那个突变.所以
: 筛选病人突变时,不能用克隆的方法,而多用PCR产物直接测序,或者为了更省钱,设计好
: PCR再酶切的方法去筛.
: 我因为是用PCR产物直接测序,这是个混合物,即时有些bp突变,不可能所有片段的那个bp
: 都突变,所以这就保证只有真正的突变才能被测序出来.因此,质疑PCR的朋友请不必再回
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O******e
发帖数: 4845 | 21 我也快受不了他啦，^_^
【在 a***e 的大作中提到】
: the problem here is that you can't repeat your data ! That has to be an
: error in the experiment.
:
: bp
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n********k
发帖数: 2818 | 22 well, it is somewhat more comprehensible this time...but it is so evident that you are the only and the very expert on the research area...so I guess
you would have to help yourself out by doing some homework:)) now...good luck,
there... |
n********k
发帖数: 2818 | 23 /..\
【在 O******e 的大作中提到】
: 我也快受不了他啦，^_^
|
n********k
发帖数: 2818 | 24 on paper, this may or may not neccesarrily be true...however, in this
particular case, I would have to agree with your instinct:))
【在 a***e 的大作中提到】
: the problem here is that you can't repeat your data ! That has to be an
: error in the experiment.
:
: bp
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z**********8
发帖数: 766 | 25 我很奇怪问问题也要被嘲笑一通，而且版主也来。。。
如果问题可笑，那能让大家笑笑也好
我就是因为不能完全repeat，所以请教是否肿瘤细胞会有部分突变而另一部分不突变的
可能性？为何觉得我的实验做错了？技术方面大家都这样做的。难道我还要被怀疑样本
搞错？
唉，无语
想起那句“小样，你新来的吧？” |
n********k
发帖数: 2818 | 26 frankly people try to help you but u kind of refuse to be helped...it could
also be we are just so layman about ur problems...so neither case would help
ur situation...anyway, a closed mind is a wonderful thing to lose...if u
are a newbie in research such as a junior graduate, then check very basics
first before u think too mysterious about ur problems, more often than not
just a trivial matter...just my two cents and good luck
【在 z**********8 的大作中提到】
: 我很奇怪问问题也要被嘲笑一通，而且版主也来。。。
: 如果问题可笑，那能让大家笑笑也好
: 我就是因为不能完全repeat，所以请教是否肿瘤细胞会有部分突变而另一部分不突变的
: 可能性？为何觉得我的实验做错了？技术方面大家都这样做的。难道我还要被怀疑样本
: 搞错？
: 唉，无语
: 想起那句“小样，你新来的吧？”
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z**********8
发帖数: 766 | 27 Thanks to your input!
Would you please recommend any books or papers about this problem? Thank you.
could
help
【在 n********k 的大作中提到】
: frankly people try to help you but u kind of refuse to be helped...it could
: also be we are just so layman about ur problems...so neither case would help
: ur situation...anyway, a closed mind is a wonderful thing to lose...if u
: are a newbie in research such as a junior graduate, then check very basics
: first before u think too mysterious about ur problems, more often than not
: just a trivial matter...just my two cents and good luck
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