n******u 发帖数: 418 | 1 我直接把chromatin pellet用SDS loading buffer去boil几分钟然后用来跑胶,但是可
能是因
为里面含有genomic DNA的原因,会比较sticky,虽然跑SDS-PAGE胶的时候sample不是很
sticky,但是跑出来之后做western发现整条lane城smear状,特别是大size的protein
,有人建
议我做一下sonication把genomic DNA震碎,我做了但是貌似不起作用,还有人建议我
treat
with DNase,但是我从来没做过,不知道这个会不会起作用,这里有没有人做过类似的
实验,如果
DNase treatment有作用的话,要加多少量并且在什么条件下treat多长时间呢?
如果这个方法也不行的话,请问还有什么别的办法可以解决smear的问题?
谢谢各位了! |
f*********r 发帖数: 1233 | 2 这是个典型的例子,即便别人给了protocol,仍然不能重复。
几点建议:
1,DNase能不用就先不用。
2,loading buffer里先不要加bromophenol blue。或者不要加太多。至少要清亮,能
看到里面是透明还是混浊还是沉淀。
或者可以先用lysis buffer,处理完了再加浓缩的loading buffer。
3,pellet加上lysis buffer以后,不要用pipette打匀。而是直接用sonication冲击。
sonication是很强的,别说一个pellet,就是坚韧的大块骨骼肌组织,都能轻易打碎。
确认pellet被彻底打散并溶解了。
4,打碎以后离心,如果不理想可以考虑超高速离心。
5,取上清(这个时候应该一点都不粘了),加loading buffer,煮,跑胶。
6,如果条带形状扭曲,可以考虑把running buffer里面的tris含量酌情加量(2-3倍,
只要低分子量的蛋白仍然跑得开,跑不开的可以用4-20%的胶)。
7,如果还不太理想,可以考虑弃用glycin running buffer,改用taurin running
buffer。 |
T**********t 发帖数: 1604 | 3 我没做过chromatin,所以说得不对的话请大家批评。
我主要是做recombinant protein expression比较多,在我用的protocol里,lysate
sonicate之后,高速离心之前的一个步骤就是加4%的PEI (polyethyleneimine)到终浓
度为0.2%左右。这一步就是为了去除DNA的,我做过gel shift,PEI处理过的蛋白跑的
胶确实没有DNA,而不经PEI处理的蛋白就会有DNA contamination,区别还是很明显的
。我的lysis buffer里没有加DNase,貌似PEI的效果就很好了。
但是不知道PEI对你的样品和后续处理有没有影响,所以只是作为参考。 |
m**z 发帖数: 787 | 4 PEI will precipitate the DNA and RNA, but it will precipitate the protein
associated with the nucleic acid as well. You can do this with 0.5 M or
higher NaCl, or wash the pellet afterwards, to decrease the protein-DNA
interaction, but some proteins will remain in the pellet.
In protein purification, this is a good step to get rid of nucleic acid, or
for purify a DNA binding proteins, etc...
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我没做过chromatin,所以说得不对的话请大家批评。 : 我主要是做recombinant protein expression比较多,在我用的protocol里,lysate : sonicate之后,高速离心之前的一个步骤就是加4%的PEI (polyethyleneimine)到终浓 : 度为0.2%左右。这一步就是为了去除DNA的,我做过gel shift,PEI处理过的蛋白跑的 : 胶确实没有DNA,而不经PEI处理的蛋白就会有DNA contamination,区别还是很明显的 : 。我的lysis buffer里没有加DNase,貌似PEI的效果就很好了。 : 但是不知道PEI对你的样品和后续处理有没有影响,所以只是作为参考。
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c******r 发帖数: 3778 | 5 如果只是为了跑western,sonicate足够了。
你load了多少protein?sonicate多大的volume?在1.5ml管子里还是15ml管子?多长时
间?多少次?
要根据体积选用不同的头。如果体积太大,sonicate效果不好。如果体积太小,
sonicate很容易起泡泡。一旦起泡泡sonicate就没用了。
一般sonicate之后弹一下管子,以不粘稠可以自由流动为准。否则就再sonicate 20秒。
之后像ls说的,离心max speed 5min,取上清,95度10分钟,冷却,上样。
是很
protein
【在 n******u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我直接把chromatin pellet用SDS loading buffer去boil几分钟然后用来跑胶,但是可 : 能是因 : 为里面含有genomic DNA的原因,会比较sticky,虽然跑SDS-PAGE胶的时候sample不是很 : sticky,但是跑出来之后做western发现整条lane城smear状,特别是大size的protein : ,有人建 : 议我做一下sonication把genomic DNA震碎,我做了但是貌似不起作用,还有人建议我 : treat : with DNase,但是我从来没做过,不知道这个会不会起作用,这里有没有人做过类似的 : 实验,如果 : DNase treatment有作用的话,要加多少量并且在什么条件下treat多长时间呢?
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S*******m 发帖数: 34 | 6 可以试试先用适量的RIPA buffer提取蛋白,然后13000rpm离心,取上清。
是很
protein
【在 n******u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我直接把chromatin pellet用SDS loading buffer去boil几分钟然后用来跑胶,但是可 : 能是因 : 为里面含有genomic DNA的原因,会比较sticky,虽然跑SDS-PAGE胶的时候sample不是很 : sticky,但是跑出来之后做western发现整条lane城smear状,特别是大size的protein : ,有人建 : 议我做一下sonication把genomic DNA震碎,我做了但是貌似不起作用,还有人建议我 : treat : with DNase,但是我从来没做过,不知道这个会不会起作用,这里有没有人做过类似的 : 实验,如果 : DNase treatment有作用的话,要加多少量并且在什么条件下treat多长时间呢?
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W****C 发帖数: 1937 | |