m******5
发帖数: 1383 | 1 小弟刚从生化转到发育领域玩
目前正在做一个Homeodomain protein,查10年来的相关的发育领域的文献（DB,
development）非常奇怪地发现都只有in situ 检测蛋白表达和分布，没有免疫组化，
也没有western
我试了市面上所有commercial抗体，也都不能在组织里检测到（western 和免疫组化）
作为阳性对照，转293 overexpress的蛋白检测起来都是没问题的
PS ：我做组织裂解液是用RIPA+超声打散的办法（组织在RIPA buffer里沉淀后直接用
超声打匀，反复三次），理论上也应该没问题？
求指教！
另外还有一个好奇的地方：很多做发育的文章也都只用ｉｎ ｓｉｔｕ来说明问题，这
是什么原因呢？ 是因为组织里免疫检测不到很正常？
另外，没有蛋白水平的检测能说明问题么？ 比如可能蛋白质已经被truncate 了 ，或
者蛋白质aggregate了 ，或者被调控降解了 ，这些都是不能用简单的insitu来证明的
吧？ |
w***e
发帖数: 269 | 2 A simple but not very helpful answer is perhaps the antibodies are not very
good. |
m******5
发帖数: 1383 | 3 you think my procedure attached for tissue lysate preparing should be OK?
I also tried TCA precipitation to concentrate tissue protein, but it still
didn't work
very
【在 w***e 的大作中提到】
: A simple but not very helpful answer is perhaps the antibodies are not very
: good.
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w***e
发帖数: 269 | 4 Yes, I think your tissue lysate preparation is fine. That's how I do it too. |
y******8
发帖数: 1764 | |
S*******m
发帖数: 34 | 6 有一些蛋白在正常组织里边就是这样的.正常情况下表达很低.只有在某些情况或某些组
织里面才高表达.
参考p53,c-Myc,progesterone receptor.
【在 m******5 的大作中提到】
: 小弟刚从生化转到发育领域玩
: 目前正在做一个Homeodomain protein,查10年来的相关的发育领域的文献（DB,
: development）非常奇怪地发现都只有in situ 检测蛋白表达和分布，没有免疫组化，
: 也没有western
: 我试了市面上所有commercial抗体，也都不能在组织里检测到（western 和免疫组化）
: 作为阳性对照，转293 overexpress的蛋白检测起来都是没问题的
: PS ：我做组织裂解液是用RIPA+超声打散的办法（组织在RIPA buffer里沉淀后直接用
: 超声打匀，反复三次），理论上也应该没问题？
: 求指教！
: 另外还有一个好奇的地方：很多做发育的文章也都只用ｉｎ ｓｉｔｕ来说明问题，这
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v***a
发帖数: 1242 | 7 我也遇到过类似的问题。一个蛋白，很少有paper是IB直接检测到的，大部分是IP再IB
。但我重复不出来。试了无数个抗体。有一个好的，能IB检测到，条带非常清晰漂亮，
跟PCR结果吻合。但过了1、2个月，这个抗体也不work了。再从那家公司买（试过同一
lot或不同lot），也都不work。所以我以前得到的result也都无法重复了。我不知道是
不是这种抗这种蛋白的抗体有某种特性的缘故。
【在 m******5 的大作中提到】
: 小弟刚从生化转到发育领域玩
: 目前正在做一个Homeodomain protein,查10年来的相关的发育领域的文献（DB,
: development）非常奇怪地发现都只有in situ 检测蛋白表达和分布，没有免疫组化，
: 也没有western
: 我试了市面上所有commercial抗体，也都不能在组织里检测到（western 和免疫组化）
: 作为阳性对照，转293 overexpress的蛋白检测起来都是没问题的
: PS ：我做组织裂解液是用RIPA+超声打散的办法（组织在RIPA buffer里沉淀后直接用
: 超声打匀，反复三次），理论上也应该没问题？
: 求指教！
: 另外还有一个好奇的地方：很多做发育的文章也都只用ｉｎ ｓｉｔｕ来说明问题，这
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m******5
发帖数: 1383 | 8 先ip再ib有reference么？ 查了一会儿都似乎有些语焉不详……
IB
【在 v***a 的大作中提到】
: 我也遇到过类似的问题。一个蛋白，很少有paper是IB直接检测到的，大部分是IP再IB
: 。但我重复不出来。试了无数个抗体。有一个好的，能IB检测到，条带非常清晰漂亮，
: 跟PCR结果吻合。但过了1、2个月，这个抗体也不work了。再从那家公司买（试过同一
: lot或不同lot），也都不work。所以我以前得到的result也都无法重复了。我不知道是
: 不是这种抗这种蛋白的抗体有某种特性的缘故。
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