p******i
发帖数: 1092 | 1 大家觉得瓶颈是哪一步？ 是前面的ReverseTranscription吗？
谁能说说有什么要点需要注意，或那个好KIT推荐一下……
多谢各位了～ |
C*******e
发帖数: 4348 | 2 自己动手做是什么意思？
另外要看你下一步是要做什么的
做RT-PCR呢
还是做primer extension呢
还是做libary呢。。。。
【在 p******i 的大作中提到】
: 大家觉得瓶颈是哪一步？ 是前面的ReverseTranscription吗？
: 谁能说说有什么要点需要注意，或那个好KIT推荐一下……
: 多谢各位了～
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p******i
发帖数: 1092 | 3 多谢～
就是老板为了省钱不想买cDNA,自己动手克隆某一个cDNA...
提细胞的RNA，做RT-PCR，然后再PCR……
【在 C*******e 的大作中提到】
: 自己动手做是什么意思？
: 另外要看你下一步是要做什么的
: 做RT-PCR呢
: 还是做primer extension呢
: 还是做libary呢。。。。
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D***a
发帖数: 516 | 4 一个cdna克隆几十块钱，何必呢？想想用掉的试剂和时间。
【在 p******i 的大作中提到】
: 多谢～
: 就是老板为了省钱不想买cDNA,自己动手克隆某一个cDNA...
: 提细胞的RNA，做RT-PCR，然后再PCR……
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Z******5
发帖数: 435 | 5 前几天刚用invitrogen的5´ RACE System for Rapid Amplification of cDNA
Ends, Version 2.0搞定一个13kb的RACE出来。
RNA质量很重要；要是只做反转录的话，invitrogen的SuperScriptTM Ⅲ First-Strand
Synthesis System可能更好；可以考虑在3'UTR位置多设计几条Gene Specific
Primers，效果比Oligo dT应该要好很多；多设计几条nested PCR引物，进行多轮扩增。
【在 p******i 的大作中提到】
: 大家觉得瓶颈是哪一步？ 是前面的ReverseTranscription吗？
: 谁能说说有什么要点需要注意，或那个好KIT推荐一下……
: 多谢各位了～
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p******i
发帖数: 1092 | 6 我现在在台湾，这里貌似没有addgene的代理……不知道海关如何……因为是邮寄细菌
的管子……
现在还在找其他家有没有卖……
【在 D***a 的大作中提到】
: 一个cdna克隆几十块钱，何必呢？想想用掉的试剂和时间。
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C*******e
发帖数: 4348 | 7 你要的基因有多长？
一个是前面RNA提得要好
做后面的实验的时候如果有可能就加些RNaseIn之类的RNase inhibitor
Ambion,Promega之类的公司都有的
另外就是反转录酶要好
像ls有人说的invitrogen的
还有我用过USB的M-MLV的也不错
【在 p******i 的大作中提到】
: 我现在在台湾，这里貌似没有addgene的代理……不知道海关如何……因为是邮寄细菌
: 的管子……
: 现在还在找其他家有没有卖……
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D***a
发帖数: 516 | 8 查查openbiosystems
【在 p******i 的大作中提到】
: 我现在在台湾，这里貌似没有addgene的代理……不知道海关如何……因为是邮寄细菌
: 的管子……
: 现在还在找其他家有没有卖……
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