m********r
发帖数: 124 | 1 我似乎前面已经发过帖子了，但是过了两周后，对这个问题知道的更多了，也有新
的疑惑，特来请教。
我的蛋白13KDa在连了N-端GB1tag后solubility增加了，也能拿到纯的，但是切掉
tag后就找不到我的蛋白了。我们一般用Ni柱，tag挂在柱上（因为有6xhis），目的蛋
白在flow-thorough.但是这个FL跑胶没东西。不是量的问题，因为浓缩后也没条带。（
我试过GST-tag，类似的结果，而且不加tag的时候我基本看不到表达条带）现在我怀疑
是降解掉了，因为上个帖子说过，结构预测N-terminal没结构，之后C-terminal 70aa
有一些二级结构。问题是在切掉tag前他已经很纯了，为什么切了tag还会降解呢？是不
是因为本身不稳定，跟有没有protease没关系？还有既然如此，我以后的生化试验是不
只能连着tag做了？唉，希望这个tag不会影响吧。 |
g*****y
发帖数: 6325 | 2 细胞裂解的时候有没有加protease inhibitor cocktail? |
q*******8
发帖数: 768 | 3 过柱子第一遍的FLOW THROUGH，洗出来的FLOW THROUGH，还有RLUTION以后的FLOW
THROUGH都做一下看看 |
m********r
发帖数: 124 | 4 sonication的时候加了PMSF和sigma的 cocktail了；
“还有RLUTION以后的FLOW THROUGH都做一下看看”是啥意思？我们这一步已经很纯了
，所以就是过柱，flowthrough，然后300mM咪唑洗了，这两部分都没我要的蛋白。 |
y*****1
发帖数: 73 | 5 降解是蛋白本身性质决定, 具体可以在expasy的protparam上查estimated参数
另外你说看不到13kda的带不排除电泳已经跑没了 可以上FPLC用uv检测 |
y*****1
发帖数: 73 | |
e****s
发帖数: 1125 | 7 如果我是你，先检查下面2个问题再考虑Protease的问题。Protease也不会切得干干净
净，你应该在胶上看到略小的带才是。
1.tag有没有切下来？
Ni-column用咪唑洗一下，跑跑看柱子上挂的是不是只有小tag.
2.没Tag了，蛋白是不是沉淀了？
酶切前后的样品高速离心一下，上清和pellet都测一下。
70aa
【在 m********r 的大作中提到】
: sonication的时候加了PMSF和sigma的 cocktail了；
: “还有RLUTION以后的FLOW THROUGH都做一下看看”是啥意思？我们这一步已经很纯了
: ，所以就是过柱，flowthrough，然后300mM咪唑洗了，这两部分都没我要的蛋白。
|
