u*********r
发帖数: 1181 | 1 条件摸的还可以， 背景噪音几乎没有很清晰，free probe也很清晰
1.可是在做竞争实验时，加入400x的unlabelled probe （与biotin labelled probe
探针一样） 就是看不出binding complex 减少的迹象， positive control 都 很好。
我用的是 LIGHTSHIFT 试剂盒。
请问是不是 nuclear extract 太多了，过量了，导致足够的factor 剩下后给label 的
probe binding。
2. 形成的binding complex 总是跑不下来，一直就是在最上面， 担心都没有地方做
super shift 了。
谢谢先 |
u*********r
发帖数: 1181 | 2 刚才考古了本版
发现有人说可能是nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。
我有点不理解，如果在没有nuclear extract 里面没有看到这样的条带，加了过后才看
到特定的条带，这个算是nonspecifec binding吗？ 在反应体系中只有这个labelled
的probe只要能binding 然后显色的不就是specific 的吗？
【在 u*********r 的大作中提到】
: 条件摸的还可以， 背景噪音几乎没有很清晰，free probe也很清晰
: 1.可是在做竞争实验时，加入400x的unlabelled probe （与biotin labelled probe
: 探针一样） 就是看不出binding complex 减少的迹象， positive control 都 很好。
: 我用的是 LIGHTSHIFT 试剂盒。
: 请问是不是 nuclear extract 太多了，过量了，导致足够的factor 剩下后给label 的
: probe binding。
: 2. 形成的binding complex 总是跑不下来，一直就是在最上面， 担心都没有地方做
: super shift 了。
: 谢谢先
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w********r
发帖数: 1431 | 3 根据你的描述，难道是有东西和biotin结合了？
【在 u*********r 的大作中提到】
: 刚才考古了本版
: 发现有人说可能是nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。
: 我有点不理解，如果在没有nuclear extract 里面没有看到这样的条带，加了过后才看
: 到特定的条带，这个算是nonspecifec binding吗？ 在反应体系中只有这个labelled
: 的probe只要能binding 然后显色的不就是specific 的吗？
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u*********r
发帖数: 1181 | 4 现在有点confused，所谓的nonspecifec binding 是指什么？
指probe 和非target protein binding？ 那么加进unbabelled 也应该有一定的竞争吧
。因为他们binding机会是一样的对于那个非target protein
【在 w********r 的大作中提到】
: 根据你的描述，难道是有东西和biotin结合了？
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g*******g
发帖数: 1769 | 5 竞争实验中你是先加入竞争probe还是先加入蛋白？如果是后者，容易理解，有可能是
结合不可逆。 |
u*********r
发帖数: 1181 | 6 我一般都是先是做一个bind buffer的 master 包含了各种东西想K,Mg，NP40,POLYDiDg
... 然后就是加入竞争probe 再加nuclear extract，在rt先反应10min 最后加
labelled probe。
【在 g*******g 的大作中提到】
: 竞争实验中你是先加入竞争probe还是先加入蛋白？如果是后者，容易理解，有可能是
: 结合不可逆。
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