w******e
发帖数: 1187 | |
J********n
发帖数: 534 | |
w******e
发帖数: 1187 | 3 比如：有一target有highly homologous protein（且称negative target），如何
改造antibody以确保specificity（不bind negative target）？
【在 J********n 的大作中提到】
: 交流一下，说说什么问题啊？
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b****r
发帖数: 17995 | 4 难道不是找一段有免疫原性可能性大又和其他蛋白不同源的序列去做抗体吗
【在 w******e 的大作中提到】
: 比如：有一target有highly homologous protein（且称negative target），如何
: 改造antibody以确保specificity（不bind negative target）？
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H****s
发帖数: 301 | 5 I am not really sure what you mean by your question. If you want an antibody
that only binds to your target protein, but not the homologous protein, you
can design your phage/yeast selection and downstream screening strategies (
you get what you select for).
If you already have an antibody that recognizes both your target and the
homologous negative target, you can engineer the antibody to keep
specificity. A good screening assay/strategy is a must here.
If I can be of any further help, please let me know. Thanks.
【在 w******e 的大作中提到】
: 比如：有一target有highly homologous protein（且称negative target），如何
: 改造antibody以确保specificity（不bind negative target）？
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w******e
发帖数: 1187 | 6 thx a lot for the input. I guess my question include both scenarios you
mentioned.
in the 1st case, can you give me a general idea how one designs the
strategy or point me to some literature? also, does that mean there is no
easy way to incorporate the specificity screening in a regular immunization-
ab generation procedure?
in the 2nd case, again can you zkss or point me to some literature?
also, can you comment on the difficulty level and the success rate of these
screening processes?
btw, if you are interested, the reason I ask is coz I want to compare the
"specificity tailoring" of antibody and aptamer.
I appreciate your help.
antibody
you
(
【在 H****s 的大作中提到】
: I am not really sure what you mean by your question. If you want an antibody
: that only binds to your target protein, but not the homologous protein, you
: can design your phage/yeast selection and downstream screening strategies (
: you get what you select for).
: If you already have an antibody that recognizes both your target and the
: homologous negative target, you can engineer the antibody to keep
: specificity. A good screening assay/strategy is a must here.
: If I can be of any further help, please let me know. Thanks.
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H****s
发帖数: 301 | 7 Usually people achieve this by phage/yeast antibody display technology. You
need to have a very good antibody library and yeast/phage library panning
capability. Once you have a pool of selected binders, you can screen them by
ELISA. In your case, two ELISA can be performed in parallel, one coated
with your target protein, the other coated with negative target protein. The
ELISA signal will give you a rough idea about target specificity. If you
have access to flow cytometry, combining flow sorting and affinity
determination will give you a clear picture.
Monoclonal antibodies can be obtained from above selection/screening process
, no matter what protein or peptide you use as antigen (as long as they can
be displayed).
If you have a working antibody already and want to engineer the antibody to
tailor the specificity, you need to know clearly the antibody amino acid
sequence and nucleic acid sequence. Once you have those, just try to figure
out the VL3 and VH3 domains (usually they determine specificity). Directed
evolution of VL3 and VH3 will probably give you the specificity. One thing
in mind, it is tedious and time-consuming.
Hopefully this helps. If you have further questions, please send me a mitbbs
message so that we do not spam the biology board.
immunization-
these
【在 w******e 的大作中提到】
: thx a lot for the input. I guess my question include both scenarios you
: mentioned.
: in the 1st case, can you give me a general idea how one designs the
: strategy or point me to some literature? also, does that mean there is no
: easy way to incorporate the specificity screening in a regular immunization-
: ab generation procedure?
: in the 2nd case, again can you zkss or point me to some literature?
: also, can you comment on the difficulty level and the success rate of these
: screening processes?
: btw, if you are interested, the reason I ask is coz I want to compare the
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w******e
发帖数: 1187 | 8 Thank you very much for the detailed information! I'll probably bug you
again later:)
You
by
The
process
can
【在 H****s 的大作中提到】
: Usually people achieve this by phage/yeast antibody display technology. You
: need to have a very good antibody library and yeast/phage library panning
: capability. Once you have a pool of selected binders, you can screen them by
: ELISA. In your case, two ELISA can be performed in parallel, one coated
: with your target protein, the other coated with negative target protein. The
: ELISA signal will give you a rough idea about target specificity. If you
: have access to flow cytometry, combining flow sorting and affinity
: determination will give you a clear picture.
: Monoclonal antibodies can be obtained from above selection/screening process
: , no matter what protein or peptide you use as antigen (as long as they can
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f**u
发帖数: 346 | 9 不是做这个的，说一个比较弱的想法。
能不能直接用你得target免疫动物，得到抗体以后先用你的negetive吸一遍，
然后再用你的target来做affinity purification。
这样得到的是多抗，但是应该可以满足你的要求。
我不了解做单抗的技术细节，有没有可能如果你这么已经拿到满足要求的多抗了，
然后再回去用那头动物想办法做单抗？
【在 w******e 的大作中提到】
: Thank you very much for the detailed information! I'll probably bug you
: again later:)
:
: You
: by
: The
: process
: can
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w******e
发帖数: 1187 | 10 negative/counter selection is a vely vely tricky business. whoever can
solve this problem rules. you can quote me on that lol~
【在 f**u 的大作中提到】
: 不是做这个的，说一个比较弱的想法。
: 能不能直接用你得target免疫动物，得到抗体以后先用你的negetive吸一遍，
: 然后再用你的target来做affinity purification。
: 这样得到的是多抗，但是应该可以满足你的要求。
: 我不了解做单抗的技术细节，有没有可能如果你这么已经拿到满足要求的多抗了，
: 然后再回去用那头动物想办法做单抗？
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f**u
发帖数: 346 | 11 给我这个门外汉多解释两句吧，具体说说到底有多tricky。
磷酸化蛋白的抗体不都是这么打的吗，给我感觉是很routine的做法。
【在 w******e 的大作中提到】
: negative/counter selection is a vely vely tricky business. whoever can
: solve this problem rules. you can quote me on that lol~
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w******e
发帖数: 1187 | 12 to answer this question, let's do a "simple" math 1st:
Say you generated polyclone antibody which let's say has only two Abs -- X (
the
"nonspecific" one), Y (the "specific" one). the ratio b/w X and Y is 100:1.
the affinity of both abs against the real target P is 1nM, while the
affinity
against the homolog Q is 10nM for X, but 1uM for Y (hence the specificity
difference). You want to add excessive amount of Q to soak off Ab X so that
the final ratio b/w X and Y is 1:10 instead of 100:1, and therefore the
mixture can be considered "specific enough". How much Q is needed?
【在 f**u 的大作中提到】
: 给我这个门外汉多解释两句吧，具体说说到底有多tricky。
: 磷酸化蛋白的抗体不都是这么打的吗，给我感觉是很routine的做法。
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H****s
发帖数: 301 | 13 Weisgone, 你是做什么的？看了你这两天的贴子，咱们有很多的overlap呀。
(
that
【在 w******e 的大作中提到】
: to answer this question, let's do a "simple" math 1st:
: Say you generated polyclone antibody which let's say has only two Abs -- X (
: the
: "nonspecific" one), Y (the "specific" one). the ratio b/w X and Y is 100:1.
: the affinity of both abs against the real target P is 1nM, while the
: affinity
: against the homolog Q is 10nM for X, but 1uM for Y (hence the specificity
: difference). You want to add excessive amount of Q to soak off Ab X so that
: the final ratio b/w X and Y is 1:10 instead of 100:1, and therefore the
: mixture can be considered "specific enough". How much Q is needed?
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w******e
发帖数: 1187 | 14 发你msg了：）
【在 H****s 的大作中提到】
: Weisgone, 你是做什么的？看了你这两天的贴子，咱们有很多的overlap呀。
:
: (
: that
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f**u
发帖数: 346 | 15 很就不算这个了，不想花太多时间再去钻。痛痛快快把你的正确答案说出来吧。
你是想说需要的Q很多，还是说在你这个假设的条件下这种富集从理论上就办不到？
(
that
【在 w******e 的大作中提到】
: to answer this question, let's do a "simple" math 1st:
: Say you generated polyclone antibody which let's say has only two Abs -- X (
: the
: "nonspecific" one), Y (the "specific" one). the ratio b/w X and Y is 100:1.
: the affinity of both abs against the real target P is 1nM, while the
: affinity
: against the homolog Q is 10nM for X, but 1uM for Y (hence the specificity
: difference). You want to add excessive amount of Q to soak off Ab X so that
: the final ratio b/w X and Y is 1:10 instead of 100:1, and therefore the
: mixture can be considered "specific enough". How much Q is needed?
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w******e
发帖数: 1187 | 16 你得到了，根本理论上就办不到：）
【在 f**u 的大作中提到】
: 很就不算这个了，不想花太多时间再去钻。痛痛快快把你的正确答案说出来吧。
: 你是想说需要的Q很多，还是说在你这个假设的条件下这种富集从理论上就办不到？
:
: (
: that
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W****C
发帖数: 1937 | 17 现在做抗体一般都是用ｐｅｐｔｉｄｅ做的吧， 难道相似到找不到差异比较大的１５
ＡＡ的区域？ |
w******e
发帖数: 1187 | 18 我对做抗体一窍不通，谁能给我讲讲，是不是随便找一段peptide都能当antigen用?
难道构象一定能跟protein上的structure一致吗？那段peptide是不是直接合成就完了？
我phd lab做ab都是用一个domain做的，如果15AA的peptide就行，那省事多了
【在 W****C 的大作中提到】
: 现在做抗体一般都是用ｐｅｐｔｉｄｅ做的吧， 难道相似到找不到差异比较大的１５
: ＡＡ的区域？
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W****C
发帖数: 1937 | 19
了？
我也没做过， 我是看到肽合成的公司推荐15AA用来做抗体。 免疫兔子的话这肯定不够
大 没抗原性。 应该是偶联到其他的蛋白比如BSA上。
【在 w******e 的大作中提到】
: 我对做抗体一窍不通，谁能给我讲讲，是不是随便找一段peptide都能当antigen用?
: 难道构象一定能跟protein上的structure一致吗？那段peptide是不是直接合成就完了？
: 我phd lab做ab都是用一个domain做的，如果15AA的peptide就行，那省事多了
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f**u
发帖数: 346 | 20 那么一定是你的假设有问题，因为实际上很多人就是这么做的。
磷酸化特意性的抗体就是合成一段十几个AA的在某个AA上磷酸化了的peptide，
然后用这个去免疫兔子，拿到多抗以后先用相同的但是没有磷酸化的peptide去吸，
吸剩下的再用磷酸化了的peptide来亲和纯化下来。
我觉得你的假设里最可能的错误就是假设只有两种抗体，而且比例悬殊。
你想想其实多抗里面可能有几百几千种不同的抗体，每种抗体之间的比例可能不那么大，
而且每个你的negative上面可能会吸附多个不同的抗体分子，
这些都会影响你的计算结果。再者，你架设你要的和不要的抗体之间的结离常数差100
倍，
实际情况也可能会差得更多。总之这套东西是work的，你如果愿意去花几个月试试，
结果可能比你想得好。可能也不需要你自己动手，花几千美金找公司就可以了。
【在 w******e 的大作中提到】
: 你得到了，根本理论上就办不到：）
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f**u
发帖数: 346 | 21 现在通常是两种做法，一是你自己表达蛋白，纯化出来寄给公司让他们给你打。
二是你让公司合成一段很短得peptide然后用他帮你免疫兔子。
好像你可以把你的蛋白全长寄给他们然后他们会分析一下然后给你推荐一段作为抗原。
当然你也可以自己分析，或者自己指定peptide的序列。
了？
【在 w******e 的大作中提到】
: 我对做抗体一窍不通，谁能给我讲讲，是不是随便找一段peptide都能当antigen用?
: 难道构象一定能跟protein上的structure一致吗？那段peptide是不是直接合成就完了？
: 我phd lab做ab都是用一个domain做的，如果15AA的peptide就行，那省事多了
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W****C
发帖数: 1937 | 22
表达的应该是融合蛋白吧， 合成的应该是偶联到别的载体上吧，10多个AA应该没免疫
原性
【在 f**u 的大作中提到】
: 现在通常是两种做法，一是你自己表达蛋白，纯化出来寄给公司让他们给你打。
: 二是你让公司合成一段很短得peptide然后用他帮你免疫兔子。
: 好像你可以把你的蛋白全长寄给他们然后他们会分析一下然后给你推荐一段作为抗原。
: 当然你也可以自己分析，或者自己指定peptide的序列。
:
: 了？
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f**u
发帖数: 346 | 23 合成蛋白通常是融合的，便于纯化，那一段东西最后也通常会被切掉。
合成的具体细节我不是很清楚，应该要有别的佐剂之类的，反正肯定就是用十几个AA。
【在 W****C 的大作中提到】
:
: 表达的应该是融合蛋白吧， 合成的应该是偶联到别的载体上吧，10多个AA应该没免疫
: 原性
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w******e
发帖数: 1187 | 24 yun...of coz the conclusion is for that specific situation. I didn't
said counter selection will never work, did I?:)
大，
100
【在 f**u 的大作中提到】
: 那么一定是你的假设有问题，因为实际上很多人就是这么做的。
: 磷酸化特意性的抗体就是合成一段十几个AA的在某个AA上磷酸化了的peptide，
: 然后用这个去免疫兔子，拿到多抗以后先用相同的但是没有磷酸化的peptide去吸，
: 吸剩下的再用磷酸化了的peptide来亲和纯化下来。
: 我觉得你的假设里最可能的错误就是假设只有两种抗体，而且比例悬殊。
: 你想想其实多抗里面可能有几百几千种不同的抗体，每种抗体之间的比例可能不那么大，
: 而且每个你的negative上面可能会吸附多个不同的抗体分子，
: 这些都会影响你的计算结果。再者，你架设你要的和不要的抗体之间的结离常数差100
: 倍，
: 实际情况也可能会差得更多。总之这套东西是work的，你如果愿意去花几个月试试，
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w******e
发帖数: 1187 | 25 请教适合用作antigen的peptide都有什么criteria？多谢！
【在 f**u 的大作中提到】
: 现在通常是两种做法，一是你自己表达蛋白，纯化出来寄给公司让他们给你打。
: 二是你让公司合成一段很短得peptide然后用他帮你免疫兔子。
: 好像你可以把你的蛋白全长寄给他们然后他们会分析一下然后给你推荐一段作为抗原。
: 当然你也可以自己分析，或者自己指定peptide的序列。
:
: 了？
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H****s
发帖数: 301 | 26 现在这些已经快过时了。多读读antibody engineering最近的综述吧。
【在 f**u 的大作中提到】
: 现在通常是两种做法，一是你自己表达蛋白，纯化出来寄给公司让他们给你打。
: 二是你让公司合成一段很短得peptide然后用他帮你免疫兔子。
: 好像你可以把你的蛋白全长寄给他们然后他们会分析一下然后给你推荐一段作为抗原。
: 当然你也可以自己分析，或者自己指定peptide的序列。
:
: 了？
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f**u
发帖数: 346 | 27 你的确没说过，但是你说过这个很tricky，我就问你为什么tricky，
你到现在也没明确回答为什么，是这样的吧。
【在 w******e 的大作中提到】
: yun...of coz the conclusion is for that specific situation. I didn't
: said counter selection will never work, did I?:)
:
: 大，
: 100
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f**u
发帖数: 346 | 28 我只用过他们的服务，具体的不清楚，你可能得问懂行的或者自己搜索了。
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教适合用作antigen的peptide都有什么criteria？多谢！
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f**u
发帖数: 346 | 29 我不做这个的，只是时不时要用几个抗体，恐怕不一定有空去读综述了。
我们到目前找公司定做的抗体都是这么做的，不过技术马上就要升级换代是很正常的。
你了解的话稍微多解释两句最新技术吧，大家学习学习。
【在 H****s 的大作中提到】
: 现在这些已经快过时了。多读读antibody engineering最近的综述吧。
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w******e
发帖数: 1187 | 30 if you could not get any clue at all from my example, then it's
my bad :)
【在 f**u 的大作中提到】
: 你的确没说过，但是你说过这个很tricky，我就问你为什么tricky，
: 你到现在也没明确回答为什么，是这样的吧。
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f**u
发帖数: 346 | 31 我考，我最不喜欢有人在讨论科学问题的时候故作高深莫测，不把话说明白。
这个话题是一个真正的科学话题，交流这样的话题，虽然是在BBS上，
也应当有观点直接亮出来，解释理由的时候直截了当的解释，
让参与话题的和旁观的都明明白白。
就像写文章，做presentation或者poster的时候一样。
【在 w******e 的大作中提到】
: if you could not get any clue at all from my example, then it's
: my bad :)
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w******e
发帖数: 1187 | 32 you are very interesting. you are smart enough to find some clue, but
reluctant
to think about the boundary condition and their ramifications yourself.
you are not bigot enough to think you know more than everyone else, but
obviously
enjoy asserting others are wrong and then go on to speculate why they are
wrong.
You are not a reviewer of my paper, we are not discussing -- you
are asking me to educate you. so remind me again why I would bother to
educate someone w/ an attitude?
I'll quit the discussion here. enjoy
【在 f**u 的大作中提到】
: 我考，我最不喜欢有人在讨论科学问题的时候故作高深莫测，不把话说明白。
: 这个话题是一个真正的科学话题，交流这样的话题，虽然是在BBS上，
: 也应当有观点直接亮出来，解释理由的时候直截了当的解释，
: 让参与话题的和旁观的都明明白白。
: 就像写文章，做presentation或者poster的时候一样。
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f**u
发帖数: 346 | 33 嗬嗬，我说一句我靠本来只是调侃之意。
如果你不喜欢这种幽默，或者觉得我冒犯你了，那很抱歉。
你也不用给我安这么多顶帽子，我可没一句话说自己懂得比别人都多。
但我不喜欢你说话不痛快是真的，你也没少打字，就是不肯直截了当的说话。
【在 w******e 的大作中提到】
: you are very interesting. you are smart enough to find some clue, but
: reluctant
: to think about the boundary condition and their ramifications yourself.
: you are not bigot enough to think you know more than everyone else, but
: obviously
: enjoy asserting others are wrong and then go on to speculate why they are
: wrong.
: You are not a reviewer of my paper, we are not discussing -- you
: are asking me to educate you. so remind me again why I would bother to
: educate someone w/ an attitude?
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H****s
发帖数: 301 | 34 很抱歉。这两天比较忙，关于抗体工程这个领域，一时半会说不清楚，因为不仅仅是学
术研究问题。如果你对这个领域有点兴趣，建议你pubmed一下以下几个人写的综述：
Richard Lerner，John McCaffery，Geoege Smith， Gregory Winter， Andrew
Bradbury和James Marks。这几个人基本上是antibody phage/yeast display领域的开
创者，并且也是抗体工程以后发展的方向。如果你对某一个人特别感兴趣，请告诉我，
我再详细给你说关于这个人的一些情况（学术研究方面的）。
【在 f**u 的大作中提到】
: 我不做这个的，只是时不时要用几个抗体，恐怕不一定有空去读综述了。
: 我们到目前找公司定做的抗体都是这么做的，不过技术马上就要升级换代是很正常的。
: 你了解的话稍微多解释两句最新技术吧，大家学习学习。
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f**u
发帖数: 346 | 35 谢谢啊，这几个人我记下了，如果以后有问题会再向你请教的。
【在 H****s 的大作中提到】
: 很抱歉。这两天比较忙，关于抗体工程这个领域，一时半会说不清楚，因为不仅仅是学
: 术研究问题。如果你对这个领域有点兴趣，建议你pubmed一下以下几个人写的综述：
: Richard Lerner，John McCaffery，Geoege Smith， Gregory Winter， Andrew
: Bradbury和James Marks。这几个人基本上是antibody phage/yeast display领域的开
: 创者，并且也是抗体工程以后发展的方向。如果你对某一个人特别感兴趣，请告诉我，
: 我再详细给你说关于这个人的一些情况（学术研究方面的）。
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W****C
发帖数: 1937 | 36
你用ｄｉｓｐｌａｙ做出过抗体嘛？估计你要是做出了也不用来这里了。。。
ＴＮＦ的ｐｈａｇｅ display的抗体都卖多少ｂｉｌｌｉｏｎ了。。。
我多年前用ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ的时候发现这个方法的最大缺点是ｂａｃｋｇ
ｒｏｕｎｄ太高， 现在已经克服了？ 要是用各种办法折腾着降低ｂａｃｋｇｒｏｕ
ｎｄ， 还真不如免疫动物来得快。。。
【在 H****s 的大作中提到】
: 很抱歉。这两天比较忙，关于抗体工程这个领域，一时半会说不清楚，因为不仅仅是学
: 术研究问题。如果你对这个领域有点兴趣，建议你pubmed一下以下几个人写的综述：
: Richard Lerner，John McCaffery，Geoege Smith， Gregory Winter， Andrew
: Bradbury和James Marks。这几个人基本上是antibody phage/yeast display领域的开
: 创者，并且也是抗体工程以后发展的方向。如果你对某一个人特别感兴趣，请告诉我，
: 我再详细给你说关于这个人的一些情况（学术研究方面的）。
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H****s
发帖数: 301 | 37 对于你第一个问题，我去年就做出了6个单抗。其中两个单抗我正在写paper（已经在抗
体工程年会上报道过了），今年应该能发出来。关于background的问题，我要告诉你的
是，现在已经不是问题。（回答你的问题是为了争一口气）。另外，从你问的问题来看
，你已经过时了，因为你现在不知道在这个领域正在发生什么。
别的不和你罗嗦，因为你太arrogant。别因为你做过display相关的技术就以老前辈自
居。我1995年就做过PCR呢，现在我都不敢说我对PCR领域了解多少。
请你不要回我的贴子，给你说话我都觉得掉价。一个人有点自知之明怎么这么难呢。
【在 W****C 的大作中提到】
:
: 你用ｄｉｓｐｌａｙ做出过抗体嘛？估计你要是做出了也不用来这里了。。。
: ＴＮＦ的ｐｈａｇｅ display的抗体都卖多少ｂｉｌｌｉｏｎ了。。。
: 我多年前用ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ的时候发现这个方法的最大缺点是ｂａｃｋｇ
: ｒｏｕｎｄ太高， 现在已经克服了？ 要是用各种办法折腾着降低ｂａｃｋｇｒｏｕ
: ｎｄ， 还真不如免疫动物来得快。。。
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