j******i
发帖数: 939 | 1 这次克隆的时候，设计pcr引物的时候，一时疏忽，直接在我的目的基因前面加了个
restriction site, pcr后插到vector里边
去。现在克隆出来了，回过头来一看才发现ATG G前面没有kozak sequence, 甚至－3不
是A or G, -6不是G. 请教这对蛋
白表达影响大吗？如果影响大的话，我干脆重新设计引物免得以后麻烦。 |
g*********5
发帖数: 2533 | 2 if you use cmv no problem because CMV is strong promoter...
if you clone in bacterial expression vector, and tag on 3'
maybe think about sd sequence. |
n***w
发帖数: 2405 | 3 我上次加了kozak，orf变了。。。
我后来就把它去掉了。。。 |
s*****i
发帖数: 315 | 4 没有kozark表达量高低是不可预测的，运气好也可能高表达
还是加上吧
【在 j******i 的大作中提到】
: 这次克隆的时候，设计pcr引物的时候，一时疏忽，直接在我的目的基因前面加了个
: restriction site, pcr后插到vector里边
: 去。现在克隆出来了，回过头来一看才发现ATG G前面没有kozak sequence, 甚至－3不
: 是A or G, -6不是G. 请教这对蛋
: 白表达影响大吗？如果影响大的话，我干脆重新设计引物免得以后麻烦。
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n***w
发帖数: 2405 | 5 但是如果用bacteria表达的话，kozak帮不了什么吧。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 没有kozark表达量高低是不可预测的，运气好也可能高表达
: 还是加上吧
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j******i
发帖数: 939 | 6 Thank you for comments! I do have CMV promotor before my gene and the
construct will be used to express in mammalian cell line. Yes, you guys are
right. Without Kozak sequence, it looks like all depends on lucky to get
high expression. To be safe, I'd better add it back to my constructs. It's
painful and a lesson I learned--to be more careful before I start an exp. |
