z***q 发帖数: 907 | 1 一个小的hairpin loop(27nt),用核磁做其结构。在水中看base pair(imino-imino,
imino-amino),folding correctly, connectivity也很多,但是5-8ppm的peaks are
totally
messed up, very broad and not well resolved.换到D2O中也是一样,即使2D
expperiemnts, 也不能很好的区分各个峰。1D上就像一个大的馒头峰,上面插着若干个
小叉子
(小尖峰)一样,无法分开各个峰。
像请问各位大侠,有人遇到过这种情况么?这个RNA 到底有没有正确折叠呢?从非变性
胶上只
看到一条清晰的条带,确定是monomer而不是dimer.如果结构不对的话,有什么方法可
以使其
正确折叠呢?我已经试过了加热快速冷却,缓慢冷却,改变盐离子浓度(50mM,100mM),
pH值
(试过4.5,6.0)都不管用,而且每次得到的谱图(1D)都不一样,都快被它搞崩溃了
。是不
是接下去只能考虑换序列了?老板也完全不能理解这种情况,只是反复和我强调我的操
作有错
误,他这么多年从来没有遇到过这种情况等等。
非常感谢各位! |
x*****o 发帖数: 441 | 2 不是太懂NMR,不知道你的核磁结果的解释是什么.
你的hairpin stem是不是GC rich,会不会没有闭合.你的Tm是多少?
还有non-denaturing gel 怎么确定不是dimer?
【在 z***q 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 一个小的hairpin loop(27nt),用核磁做其结构。在水中看base pair(imino-imino, : imino-amino),folding correctly, connectivity也很多,但是5-8ppm的peaks are : totally : messed up, very broad and not well resolved.换到D2O中也是一样,即使2D : expperiemnts, 也不能很好的区分各个峰。1D上就像一个大的馒头峰,上面插着若干个 : 小叉子 : (小尖峰)一样,无法分开各个峰。 : 像请问各位大侠,有人遇到过这种情况么?这个RNA 到底有没有正确折叠呢?从非变性 : 胶上只 : 看到一条清晰的条带,确定是monomer而不是dimer.如果结构不对的话,有什么方法可
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z***q 发帖数: 907 | 3 谢谢回复!
结果的解释就是所有supposed base pairs都形成了,hairpin stem有9个base pairs,
只有2个GC,Tm没测过,算出来的是54C,自由能也很低,因为序列开始是2个UU base
pair,可能不太稳定,但是从核磁上看UU base pair都形成了,所以感觉很矛盾。试过
端基变成GC,然后就发现了很多dimer.non-denaturing gel上是根据别的已知样品的对
照。
【在 x*****o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 不是太懂NMR,不知道你的核磁结果的解释是什么. : 你的hairpin stem是不是GC rich,会不会没有闭合.你的Tm是多少? : 还有non-denaturing gel 怎么确定不是dimer?
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x*****o 发帖数: 441 | 4 我觉得可能是有很多dynamics, 结构不稳定. 你看到到的有可能有好几个comformation
的混合物. RNA的结构很多变,dynamics是特点.
看看能不能再多加点一价金属,稳定一下结构.其实稳定结构镁离子最好,但是听说NMR不
能用镁.
【在 z***q 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢回复! : 结果的解释就是所有supposed base pairs都形成了,hairpin stem有9个base pairs, : 只有2个GC,Tm没测过,算出来的是54C,自由能也很低,因为序列开始是2个UU base : pair,可能不太稳定,但是从核磁上看UU base pair都形成了,所以感觉很矛盾。试过 : 端基变成GC,然后就发现了很多dimer.non-denaturing gel上是根据别的已知样品的对 : 照。
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s***m 发帖数: 6197 | 5
comformation
没这个说法。Mg2+这么重要的阳离子怎么可能不用。
【在 x*****o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我觉得可能是有很多dynamics, 结构不稳定. 你看到到的有可能有好几个comformation : 的混合物. RNA的结构很多变,dynamics是特点. : 看看能不能再多加点一价金属,稳定一下结构.其实稳定结构镁离子最好,但是听说NMR不 : 能用镁.
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T**********t 发帖数: 1604 | 6 Ambion的网站上说镁离子的存在会让RNA产生非特异性降解:
http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_159.html
不过我们实验室确实也用含Mg的buffer做过RNA的NMR就是了。可惜我不做NMR,lz的问
题我答不上来。
【在 s***m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : comformation : 没这个说法。Mg2+这么重要的阳离子怎么可能不用。
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x*****o 发帖数: 441 | 7 和很多做RNA NMR的谈过,镁离子浓度过高会使谱图看起来很差,所以他们使用不超过5mM
. 要是想要稳定RNA结构,在buffer里面至少需要10mM.
你是做RNA NMR的?你平时用什么浓度?
【在 s***m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : comformation : 没这个说法。Mg2+这么重要的阳离子怎么可能不用。
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r********d 发帖数: 58 | 8 hehe,多重构象
把盐脱掉
buffer用5个mM就可以了
【在 z***q 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 一个小的hairpin loop(27nt),用核磁做其结构。在水中看base pair(imino-imino, : imino-amino),folding correctly, connectivity也很多,但是5-8ppm的peaks are : totally : messed up, very broad and not well resolved.换到D2O中也是一样,即使2D : expperiemnts, 也不能很好的区分各个峰。1D上就像一个大的馒头峰,上面插着若干个 : 小叉子 : (小尖峰)一样,无法分开各个峰。 : 像请问各位大侠,有人遇到过这种情况么?这个RNA 到底有没有正确折叠呢?从非变性 : 胶上只 : 看到一条清晰的条带,确定是monomer而不是dimer.如果结构不对的话,有什么方法可
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r********d 发帖数: 58 | 9 如果9个base pair中只有两个GC的话,那你的这个结构肯定不稳定
【在 z***q 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢回复! : 结果的解释就是所有supposed base pairs都形成了,hairpin stem有9个base pairs, : 只有2个GC,Tm没测过,算出来的是54C,自由能也很低,因为序列开始是2个UU base : pair,可能不太稳定,但是从核磁上看UU base pair都形成了,所以感觉很矛盾。试过 : 端基变成GC,然后就发现了很多dimer.non-denaturing gel上是根据别的已知样品的对 : 照。
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z***q 发帖数: 907 | 10 非常感谢!
NMR可以用镁,但是浓度不能太高,因为镁可以broadern peaks.至于降解,只要温度低
于30C应该没有太大问题。
但是,想请问一下,如果没有已知的镁binding site,generally 镁仍可以稳定结构么?
非常感谢!
comformation
【在 x*****o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我觉得可能是有很多dynamics, 结构不稳定. 你看到到的有可能有好几个comformation : 的混合物. RNA的结构很多变,dynamics是特点. : 看看能不能再多加点一价金属,稳定一下结构.其实稳定结构镁离子最好,但是听说NMR不 : 能用镁.
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z***q 发帖数: 907 | 11 非常感谢!
请问你说buffer用5个mM是指5mM NaCl? 盐离子不是用来稳定结构的么?为什么脱盐后
反而可以改善多重构向呢?
谢谢!
【在 r********d 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : hehe,多重构象 : 把盐脱掉 : buffer用5个mM就可以了
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z***q 发帖数: 907 | 12 感觉结构是不太稳定,因为20C以上峰就更broad,完全成了馒头,连小叉子都看不见了。
但是为什么在imino region看不出多重构向呢?主要是imino region太好了,搞得老板
总是不想放弃,就说我做得不对,但他也不知道哪里不对。
请问现在只有改序列这一种办法了么?
【在 r********d 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果9个base pair中只有两个GC的话,那你的这个结构肯定不稳定
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z***q 发帖数: 907 | 13 对的,镁离子浓度过高会使谱图看起来很差,所以一般不会超过5mM
但是,请问“要是想要稳定RNA结构,在buffer里面至少需要10mM”这个是对于任何浓度
的RNA都适用的么?
谢谢!
5mM
【在 x*****o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 和很多做RNA NMR的谈过,镁离子浓度过高会使谱图看起来很差,所以他们使用不超过5mM : . 要是想要稳定RNA结构,在buffer里面至少需要10mM. : 你是做RNA NMR的?你平时用什么浓度?
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r********d 发帖数: 58 | 14 盐浓度越高,越有利于稳定dimer,trimer等结构
盐浓度低一点对single hairpin好
你干脆别加盐了,如果buffer是用phosphate来控制pH的话,那么加5mM的phosphate就
可以了
你sample concentration是多少?
【在 z***q 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 非常感谢! : 请问你说buffer用5个mM是指5mM NaCl? 盐离子不是用来稳定结构的么?为什么脱盐后 : 反而可以改善多重构向呢? : 谢谢!
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r********d 发帖数: 58 | 15 在结构末端多加两个basepair,把结构稳定下来
同时把盐脱掉,防止dimer的形成
再就是做NMR之前用heat and fast cool,不过个人感觉这个没啥帮助
了。
【在 z***q 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 感觉结构是不太稳定,因为20C以上峰就更broad,完全成了馒头,连小叉子都看不见了。 : 但是为什么在imino region看不出多重构向呢?主要是imino region太好了,搞得老板 : 总是不想放弃,就说我做得不对,但他也不知道哪里不对。 : 请问现在只有改序列这一种办法了么?
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r********d 发帖数: 58 | 16 在25度的时候,imnino region还好吗?
了。
【在 z***q 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 感觉结构是不太稳定,因为20C以上峰就更broad,完全成了馒头,连小叉子都看不见了。 : 但是为什么在imino region看不出多重构向呢?主要是imino region太好了,搞得老板 : 总是不想放弃,就说我做得不对,但他也不知道哪里不对。 : 请问现在只有改序列这一种办法了么?
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x*****o 发帖数: 441 | 17 Mg 有效的中和RNA backbone 的负电荷,可以稳定二,三级结构. Na或者K没有Mg有效,
一般认为稳定的是RNA的二级结构.如果在没有镁的情况下,大量的单价离子 (1M)可以减
少 non-specific binding,稳定特定的conformation. 但是不知道NMR是不是不能用大
量的单价离子.
我们实验室以前也用hairpin(虽然不是核磁)hairpin ribozyme, 但是觉得mg 在10mM
的时候效果最好.
我以前有朋友做RNA NMR, 也是hairpin,不过他们的stem是GC rich的,比较稳定.
【在 z***q 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 对的,镁离子浓度过高会使谱图看起来很差,所以一般不会超过5mM : 但是,请问“要是想要稳定RNA结构,在buffer里面至少需要10mM”这个是对于任何浓度 : 的RNA都适用的么? : 谢谢! : : 5mM
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s***m 发帖数: 6197 | 18 同意rutherford的说法
你按他的建议试试看先
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
这个是要在不形成dimer的前提下
10mM
【在 x*****o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Mg 有效的中和RNA backbone 的负电荷,可以稳定二,三级结构. Na或者K没有Mg有效, : 一般认为稳定的是RNA的二级结构.如果在没有镁的情况下,大量的单价离子 (1M)可以减 : 少 non-specific binding,稳定特定的conformation. 但是不知道NMR是不是不能用大 : 量的单价离子. : 我们实验室以前也用hairpin(虽然不是核磁)hairpin ribozyme, 但是觉得mg 在10mM : 的时候效果最好. : 我以前有朋友做RNA NMR, 也是hairpin,不过他们的stem是GC rich的,比较稳定.
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z***q 发帖数: 907 | 19 非常感谢你的建议!
我们实验室现在一般不用phosphate,直接用H2O+NaCl,然后pH the sample,据说得到的
谱图比较好,所以我从来没有试过加phosphate。
不过这样做可能的确有问题,pH 也不太准,我试试用5mM的phosphate,不加盐离子看
看吧
sample concentration 大约0.9-1mM.
请问这个浓度能做natural-abundance N15-HSQC么?
非常感谢!
【在 r********d 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 盐浓度越高,越有利于稳定dimer,trimer等结构 : 盐浓度低一点对single hairpin好 : 你干脆别加盐了,如果buffer是用phosphate来控制pH的话,那么加5mM的phosphate就 : 可以了 : 你sample concentration是多少?
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z***q 发帖数: 907 | 20 不好了。
不过即使稳定的结构,imino到了25度也会因为fast exchange 看不到了吧?
【在 r********d 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 在25度的时候,imnino region还好吗? : : 了。
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z***q 发帖数: 907 | 21 就是说结构不稳定主要是端基没有GC的原因了?
我曾经做过一个mutation,就是把端基的2个UU都去掉,再把邻近UU的AU变成GC,这样就
有2个GC连在一起,可以transcribe了。然后发现得到的样品dimer有大概30%-40%,这
是不是说明不仅stem,其实loop也不稳定?
非常感谢!
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
这个我感觉也没什么用
【在 r********d 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 在结构末端多加两个basepair,把结构稳定下来 : 同时把盐脱掉,防止dimer的形成 : 再就是做NMR之前用heat and fast cool,不过个人感觉这个没啥帮助 : : 了。
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z***q 发帖数: 907 | 22 恩,谢谢回复
【在 s***m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 同意rutherford的说法 : 你按他的建议试试看先 : : ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ : 这个是要在不形成dimer的前提下 : 10mM
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r********d 发帖数: 58 | 23 我觉得15N实验悬
不过可以试试吗,呵呵
pH还是要控制的,一般都是用buffer控制,不明白你说pH the sample是什么意思?
【在 z***q 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 非常感谢你的建议! : 我们实验室现在一般不用phosphate,直接用H2O+NaCl,然后pH the sample,据说得到的 : 谱图比较好,所以我从来没有试过加phosphate。 : 不过这样做可能的确有问题,pH 也不太准,我试试用5mM的phosphate,不加盐离子看 : 看吧 : sample concentration 大约0.9-1mM. : 请问这个浓度能做natural-abundance N15-HSQC么? : 非常感谢!
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r********d 发帖数: 58 | 24 那真是不稳定啊,呵呵
举个例子,DNA双螺旋的imino你到40度可能都还看得到,就因为这个结构非常稳定,呵呵
【在 z***q 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 不好了。 : 不过即使稳定的结构,imino到了25度也会因为fast exchange 看不到了吧?
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r********d 发帖数: 58 | 25 这个问题要分两重看
第一,你加了GC之后,hirpin是比原来稳定了
第二,你加了GC之后新的序列形成的dimer可能比single hairpin更稳定,这个就和序
列有关了,没拿到结构,谁也说不太清楚,呵呵
【在 z***q 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 就是说结构不稳定主要是端基没有GC的原因了? : 我曾经做过一个mutation,就是把端基的2个UU都去掉,再把邻近UU的AU变成GC,这样就 : 有2个GC连在一起,可以transcribe了。然后发现得到的样品dimer有大概30%-40%,这 : 是不是说明不仅stem,其实loop也不稳定? : 非常感谢! : : ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ : 这个我感觉也没什么用
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z***q 发帖数: 907 | 26 非常感谢你的回复!
pH the sample就是调样品的pH值啊,直接用NaOH,调到6左右。据说磷酸盐也会使谱图
变差,我没有试过。
【在 r********d 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我觉得15N实验悬 : 不过可以试试吗,呵呵 : pH还是要控制的,一般都是用buffer控制,不明白你说pH the sample是什么意思?
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z***q 发帖数: 907 | 27 哦,长见识了,从来没有试过40C。。。。。
呵呵
【在 r********d 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那真是不稳定啊,呵呵 : 举个例子,DNA双螺旋的imino你到40度可能都还看得到,就因为这个结构非常稳定,呵呵
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z***q 发帖数: 907 | 28 恩,你说的很有道理
感觉RNA的结构基本上由序列决定了,序列不行,怎么做都不行。。
再次感谢你的回复,给你发个包子吧
【在 r********d 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个问题要分两重看 : 第一,你加了GC之后,hirpin是比原来稳定了 : 第二,你加了GC之后新的序列形成的dimer可能比single hairpin更稳定,这个就和序 : 列有关了,没拿到结构,谁也说不太清楚,呵呵
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