s******y
发帖数: 220 | 1 我做mouse NFAt c3的IP, 预测的分子量应该是115Kd， 我IP下来大概100Kd有带，
但是input 里面分子量变大了快到150Kd，（略小于100也有浅带，但不是IP那条）
为什么会这样呢？
有人说可能是sumoylation， 可是为啥IP下来这修饰就没了呢？
谢谢。 |
z********i
发帖数: 610 | 2 首先，网上好好查一下，看跑出来的分子量到底是多大。
其次，确认一下你的抗体有没有问题，是否能做IP.哪怕是公司说能做，如果是第一次
用，最好还是确认一下。
如果这些都没有问题，然后再来看看。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我做mouse NFAt c3的IP, 预测的分子量应该是115Kd， 我IP下来大概100Kd有带，
: 但是input 里面分子量变大了快到150Kd，（略小于100也有浅带，但不是IP那条）
: 为什么会这样呢？
: 有人说可能是sumoylation， 可是为啥IP下来这修饰就没了呢？
: 谢谢。
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s******y
发帖数: 28562 | 3 有一个可能就是你那个全长的蛋白因为一些构象原因不能被pulldown,
反而是被切过的（或者alternatively splice) 的可以被pulldown.
如果你开始用的是native buffer pulldown 的话，不妨换成denaturing pulldown
condition
比方说用 2 %SDS 把细胞给煮了，然后加缓冲液稀释到0.2% SDS再pulldown,
这样一方面可以解决大部分构象原因，另外一方面也会减少背景
当然，如果你比较倒霉的话，这样也有可能导致你什么都pulldown 不下来。这个你得
试一试，就没有人敢给你保证了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我做mouse NFAt c3的IP, 预测的分子量应该是115Kd， 我IP下来大概100Kd有带，
: 但是input 里面分子量变大了快到150Kd，（略小于100也有浅带，但不是IP那条）
: 为什么会这样呢？
: 有人说可能是sumoylation， 可是为啥IP下来这修饰就没了呢？
: 谢谢。
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r**a
发帖数: 121 | 4 我也碰到类似的情况
我的是IP下来的，比input稍微高一点
一个如果60，一个可能就60－65KD
一开始以为是磷酸化，加了ppase，还在原来位置
现在也不知道，那个到底是非特异性的
还是什么修饰
【在 s******y 的大作中提到】
: 我做mouse NFAt c3的IP, 预测的分子量应该是115Kd， 我IP下来大概100Kd有带，
: 但是input 里面分子量变大了快到150Kd，（略小于100也有浅带，但不是IP那条）
: 为什么会这样呢？
: 有人说可能是sumoylation， 可是为啥IP下来这修饰就没了呢？
: 谢谢。
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s******y
发帖数: 28562 | 5 你们拖下来的带有没有WB confirm 并送去质谱证实一下？
【在 r**a 的大作中提到】
: 我也碰到类似的情况
: 我的是IP下来的，比input稍微高一点
: 一个如果60，一个可能就60－65KD
: 一开始以为是磷酸化，加了ppase，还在原来位置
: 现在也不知道，那个到底是非特异性的
: 还是什么修饰
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