b******s
发帖数: 1089 | 1 2D bleach size 可以直观看见，但是怎么知道z轴方向被bleach多少厚度?
confocal is Leica SP2
谢谢. |
s******y
发帖数: 28562 | 2 一般来说，就是那个理论上的光深度(optical section thickness)，在你所用的显微镜
软件里应该有根据镜头参数换算出来的估计值
【在 b******s 的大作中提到】
: 2D bleach size 可以直观看见，但是怎么知道z轴方向被bleach多少厚度?
: confocal is Leica SP2
: 谢谢.
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b******s
发帖数: 1089 | 3 多谢sunny。
confocal有俩pinholes。bleach在axis上的厚度应该只与入射光的pinhole有关。而且
一般软件里给的估计值是基于point spread function，入射光波长488nm的时候，axis
上估算值大概是500nm。但是在一个给定的ROI内，scanned的points很多，这样最后在
axis上被漂白的区域远远不止500nm。不知道这样理解对不对？
微镜 |
h*******v
发帖数: 27 | 4 To my understanding, pinhole is just before PMT detector, and can't
exclude anything from the laser. The laser beam will penetrate the whole
sample...Hope someone can clarify that.
【在 b******s 的大作中提到】
: 2D bleach size 可以直观看见，但是怎么知道z轴方向被bleach多少厚度?
: confocal is Leica SP2
: 谢谢.
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b******s
发帖数: 1089 | 5 扫描confocal有两个pinhole
入射光的pinhole可以使得入射光成为一个point light source，这样即使penetrate进
入tissue，根据airy disc图，focal plane之外的illumination越远越可以忽略不计。
optical section跟俩个pinhole都有关系，但是我觉得bleaching effect和
detector前的pinhole没有关系。
【在 h*******v 的大作中提到】
: To my understanding, pinhole is just before PMT detector, and can't
: exclude anything from the laser. The laser beam will penetrate the whole
: sample...Hope someone can clarify that.
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s*****j
发帖数: 6435 | 6 就一个pinhole. 激光直接fiber couple进入scanhead.
这个不能看airy disk的图, 得看公司提供的scan-head的光路图.
【在 b******s 的大作中提到】
: 扫描confocal有两个pinhole
: 入射光的pinhole可以使得入射光成为一个point light source，这样即使penetrate进
: 入tissue，根据airy disc图，focal plane之外的illumination越远越可以忽略不计。
: optical section跟俩个pinhole都有关系，但是我觉得bleaching effect和
: detector前的pinhole没有关系。
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s*****j
发帖数: 6435 | 7 扫个3D的stack来算.
bleach的时候发生什么事鬼才知道. 不能靠猜.
【在 b******s 的大作中提到】
: 2D bleach size 可以直观看见，但是怎么知道z轴方向被bleach多少厚度?
: confocal is Leica SP2
: 谢谢.
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b******s
发帖数: 1089 | 8 能具体讲讲是怎么做的吗？
【在 s*****j 的大作中提到】
: 扫个3D的stack来算.
: bleach的时候发生什么事鬼才知道. 不能靠猜.
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s*****j
发帖数: 6435 | 9 confocal 不就是那来扫三维的吗? bleach完以后, 扫一个, 你就知道在z方向bleach
了多少了.
【在 b******s 的大作中提到】
: 能具体讲讲是怎么做的吗？
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b******s
发帖数: 1089 | 10 明白，xzy scan是不是也可以？
除了empirically测量，有没有理论模型可以比较准确估算厚度？
bleach
【在 s*****j 的大作中提到】
: confocal 不就是那来扫三维的吗? bleach完以后, 扫一个, 你就知道在z方向bleach
: 了多少了.
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b*****l
发帖数: 9499 | 11 会不会 z 方向上的 resolution 太低？
【在 s*****j 的大作中提到】
: confocal 不就是那来扫三维的吗? bleach完以后, 扫一个, 你就知道在z方向bleach
: 了多少了.
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Z****9
发帖数: 738 | 12 pinhole是PMT前面的一个小孔，用来屏蔽样本上out focus的光，与laser对样本的
bleach没有任何关系
laser在不同的位置的强度可以通过公式计算出来，bleach的速度与laser的强度相关，
理论上是可以计算的
但是由于不同的样本对光的穿透性不同，以及样本对光的散射，导致无法精确计算在样
本上不同位置的光强度
如果你的东西bleach特别快，用3d扫描不是一个很可行的方法
当你在扫描某一个layer的过程中，你同时bleach所有layer的样本
【在 b******s 的大作中提到】
: 明白，xzy scan是不是也可以？
: 除了empirically测量，有没有理论模型可以比较准确估算厚度？
:
: bleach
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s*****j
发帖数: 6435 | 13 不存在什么模型的问题. point scan confocal的光路是个cone structure. 焦点处光
强最大, 嚗光时间短. 其他地方光强小, 嚗光时间长. 那些地方会bleach点是算不出来
的.
bleach的原理是什么现在也是糊里糊涂的. invitrogen的所谓anti-bleach agent有没
有用全靠运气了.
leica SP2 如果你有piezo z-stage, 就扫一个xyz/xzy很快的.
【在 b******s 的大作中提到】
: 明白，xzy scan是不是也可以？
: 除了empirically测量，有没有理论模型可以比较准确估算厚度？
:
: bleach
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