b******s 发帖数: 1089 | 1 我做三片段连接。entry clone都测过序。但是三片段重组之后总是有一些问题。首先
,每次都有colony。我用不同片段和载体上的primers检测,有时候有些primer组合出
带,有些不出。有时候带还不错,但是size有些移动。最后只好又去测序。有些克隆的
峰乱糟糟叠在一起。有些有clean的峰,但是sequence又不完全match。克隆重复划板,
liquid culture都非常正常。
我一般程序是三片段entry clone加载体每个大约1-1.5ul,LR clonase 1ul,25度反应
18-24h, heat shock之后培养2-3h再涂板。反应和培养时间是否太长?重组反应时间太
长会有问题吗?
另外,我所有的东西都是从同实验室日本博后那要来的。entry clone我自己后来测过
序,但是载体没有。原本来怀疑是载体,就用酶切检测没成功。日本博后告诉我载体是
改造过的,真实序列和他给我的sequence可能不一样。我用几对primers检测,都是对
的。
有经验的能否指教一下可能问题在哪?谢谢 |
b******s 发帖数: 1089 | 2 算了,我给了abstract吧:
multisite gateway为什么colony看起来很正常(spec resistant),PCR结果不稳定,
sequence结果悲剧?
【在 b******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我做三片段连接。entry clone都测过序。但是三片段重组之后总是有一些问题。首先 : ,每次都有colony。我用不同片段和载体上的primers检测,有时候有些primer组合出 : 带,有些不出。有时候带还不错,但是size有些移动。最后只好又去测序。有些克隆的 : 峰乱糟糟叠在一起。有些有clean的峰,但是sequence又不完全match。克隆重复划板, : liquid culture都非常正常。 : 我一般程序是三片段entry clone加载体每个大约1-1.5ul,LR clonase 1ul,25度反应 : 18-24h, heat shock之后培养2-3h再涂板。反应和培养时间是否太长?重组反应时间太 : 长会有问题吗? : 另外,我所有的东西都是从同实验室日本博后那要来的。entry clone我自己后来测过 : 序,但是载体没有。原本来怀疑是载体,就用酶切检测没成功。日本博后告诉我载体是
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s********n 发帖数: 2939 | 3 你得到的Clones的sequence是些什么东西?还有就是你的Destination vector的序列正
确吗? |
i***l 发帖数: 1656 | 4 sequencing all constructs you start with
make sure stuffs are correct at the beginning
【在 b******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 算了,我给了abstract吧: : multisite gateway为什么colony看起来很正常(spec resistant),PCR结果不稳定, : sequence结果悲剧?
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