p******y
发帖数: 47 | 1 实验室当年发现了个蛋白，所有试验都是用overexpressioin做的，endogenous的蛋白
原来也做出来过，但是当年那个抗体不行了。老板又定了新的抗体，但是咋测都测不出
来。现在只有先IP再WB，但是即使用到2mg的蛋白做IP，还是测不到.TransctriptsS是
肯定有的，做过immunostaining 也饿凑凑活活能看见。就是WB不行。已经捣鼓了很长
时间了，很郁闷的说，请问大家有什么方法可以解决这个问题吗。谢谢大家。 |
f********n
发帖数: 6465 | 2 换特异性抗体.
有时侯抗TAG,FLAG或者非特异部分的抗体做不出来,换成特异性抗体就可以做出来.
我们还是膜蛋白呢,换了之后就做出来了. |
h*******o
发帖数: 4884 | 3 western 信号强化３步流
１）转膜完了用Ｑentix强化一把
２）Ｄevelop的时候用femto substrates
３）用传统胶片取代ＣＣＤ的电子系统
都不行的话，换抗体吧
【在 p******y 的大作中提到】
: 实验室当年发现了个蛋白，所有试验都是用overexpressioin做的，endogenous的蛋白
: 原来也做出来过，但是当年那个抗体不行了。老板又定了新的抗体，但是咋测都测不出
: 来。现在只有先IP再WB，但是即使用到2mg的蛋白做IP，还是测不到.TransctriptsS是
: 肯定有的，做过immunostaining 也饿凑凑活活能看见。就是WB不行。已经捣鼓了很长
: 时间了，很郁闷的说，请问大家有什么方法可以解决这个问题吗。谢谢大家。
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o**4
发帖数: 35028 | 4 你们的新抗体应该有问题
【在 p******y 的大作中提到】
: 实验室当年发现了个蛋白，所有试验都是用overexpressioin做的，endogenous的蛋白
: 原来也做出来过，但是当年那个抗体不行了。老板又定了新的抗体，但是咋测都测不出
: 来。现在只有先IP再WB，但是即使用到2mg的蛋白做IP，还是测不到.TransctriptsS是
: 肯定有的，做过immunostaining 也饿凑凑活活能看见。就是WB不行。已经捣鼓了很长
: 时间了，很郁闷的说，请问大家有什么方法可以解决这个问题吗。谢谢大家。
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p******y
发帖数: 47 | 5 哎，我也怀疑是抗体有问题的，但是这个抗体可以用来做IP，能IP外原的蛋白。所以老
板始终不渝的相信这个抗体是没有问题的。 |
h*******n
发帖数: 2052 | 6 Antibody used in IP does not necessarily work for Western Blot. |
p******y
发帖数: 47 | 7 有道理额。那我就还是overexpress这个蛋白，看看能不能用这个抗体把exogenous的检
测出来。 |
r********g
发帖数: 109 | 8 1. Load more sample (100-200 ug).
2. Use fresh sample (AFAP).
3. Positive control.
4. Do not boil your sample or shorten the boiling time (less than 3 min)
5. Increase primary antibody concentration.
6. Change antibody.
7. Give up if you still cannot detect it after trying 3-5 antibodies. |
p******y
发帖数: 47 | 9 谢谢楼上的。我最后都加到300UG的蛋白了，还是啥都么有~
我试试SHORTEN BOIL TIME 这次~
这个蛋白应该是能测到的，原来的AB就可以，但是原来那个FROZEN AND THAW了很多次
以后就彻底罢工了~哎 |
r********g
发帖数: 109 | 10 FROZEN AND THAW killed the antibody.
【在 p******y 的大作中提到】
: 谢谢楼上的。我最后都加到300UG的蛋白了，还是啥都么有~
: 我试试SHORTEN BOIL TIME 这次~
: 这个蛋白应该是能测到的，原来的AB就可以，但是原来那个FROZEN AND THAW了很多次
: 以后就彻底罢工了~哎
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