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b******s
发帖数: 1089
1
本来容易的gateway cloning成了最近几个月摧毁我身心健康的罪魁祸首。
哎,说来话长。先来介绍背景:1年前开始用gateway做克隆。在此之前实验室也一直用
gateway,但是实验室很小,我之前只有一个日本博后。做了好几年。几乎所有的东西
都是从他那里来。我们用的是multisite gateway,细说就是三个entry clone和载体一
起连。
我做了N次(我都不好意思说N等于多少了),一个确定的都没成功。
症状:每次连接之后转e coli都有菌落,而且菌落看起来正常。介入液体摇也正常生长
(spectinomycin resistance)。但是colony PCR有时会有不浓的bands,size貌似正
确,但是很多时候PCR失败。提plasmid PCR也失败,酶切也失败。
可能一:entry clone有问题。用gateway做entry clone很容易,应该不会,我做了好
几个entry clone,都sequence过,PCR检测等很正常。
可能二:我哪里做错了。至少我现在想起来应该没有。我经过无数次改进,从反应DNA
浓度到反应时间到heat shock转化,我实在想不出来哪里还会有问题。而且我用其他
destination vector(非三片段的)做LR反应也没有问题。
可能三:这是我后来一直怀疑的。就是载体有问题。我试着用空载体转过DH5alpha发现
竟然也有colony。从那以后,我就比较警觉,觉得日本博后给我的载体可能有问题。我
就直接用他刚用过并成功过的载体直接扩增。提质粒再转染,这次没有false positive
colony了。但是比奇怪的是,用新的载体做结果还跟以前一样。但是似乎colony不如
以前多。(忘了补充,我以前做三片段连接常能长出30+ colony来,现在少了一些,5-
20的样子)
可能四:就是其他试剂被污染。真是神了。日本博后同时用同样的方法做,都成功。奇
怪的是,我找其他实验室借材料做其他克隆,都能成功,就是用本实验室的材料做
mutisite gateway没法成功。
我也怀疑过日本博后,在课题某些方面我们有竞争。但是我觉得认为破坏应该可能性很
小!我整天在实验室,比他待的时间长。另外他也看起来老实的样子。而且现在载体
PCR酶切都对。我不知道还有什么可以怀疑的。难道我的entry vector被加了啥?
有人劝我换传统的方法做克隆,可是。。。我们那么多entry vector都做好了现成的。
而且那日本博后一直成功,怎么就我一直失败。。。没道理啊。
一个简单的实验,反反复复的失败。已经把我折磨成祥林嫂。希望有耐心的同学看完了
絮叨给我建议,让我早点变回正常人。谢谢
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