s***o
发帖数: 1189 | 1 请问测序高手，
construct 经限制性酶切后 做胶回收 然后 酶切片断 可否测序？？
课题需要，在construct里构建double sequence （～2.5kb）。测序遇到麻烦。
谢谢 |
i***l
发帖数: 1656 | 2 可以
【在 s***o 的大作中提到】
: 请问测序高手，
: construct 经限制性酶切后 做胶回收 然后 酶切片断 可否测序？？
: 课题需要，在construct里构建double sequence （～2.5kb）。测序遇到麻烦。
: 谢谢
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k****l
发帖数: 279 | 3 理论上可以，但是难度比较大，主要是从胶里提取一般不纯，有agarose |
j****x
发帖数: 1704 | 4 何难之有？PCR产物切胶回收测序没做过？
【在 k****l 的大作中提到】
: 理论上可以，但是难度比较大，主要是从胶里提取一般不纯，有agarose
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s***o
发帖数: 1189 | 5
你是不是试过啊，
我学校测序中心问，技术员说以前也有尝试过，不知为什么测不出来。
【在 k****l 的大作中提到】
: 理论上可以，但是难度比较大，主要是从胶里提取一般不纯，有agarose
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c******r
发帖数: 3778 | 6 extract一下，然后precipitate试试看
【在 s***o 的大作中提到】
:
: 你是不是试过啊，
: 我学校测序中心问，技术员说以前也有尝试过，不知为什么测不出来。
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s***o
发帖数: 1189 | 7
I have been scratching my head and still couldn't understand why our core
facility said it was close to impossible.
In theory, there is nothing really tricky....
【在 c******r 的大作中提到】
: extract一下，然后precipitate试试看
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c******r
发帖数: 3778 | 8 should be a routine procedure. Double check with them why they think it's
close to impossible.
btw, what's your experimental design? details
【在 s***o 的大作中提到】
:
: I have been scratching my head and still couldn't understand why our core
: facility said it was close to impossible.
: In theory, there is nothing really tricky....
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c****1
发帖数: 1095 | 9 直接测序片段，要设计引物，这个就有不确定性。连到T-easy或者TOPO载体，用T7，很
方便。 |
s***o
发帖数: 1189 | 10 谢谢大家，和测序中心几个人交流后，
得到一个比较合理的解释：
酶切会影响得率，对非high copy的plasmid影响尤其严重。
而gel回收在融胶时候，会有DNA的变性和复性，有的序列可能形成不规则结构比如三链。
估计要把insert subclone到比如 T-easy里面了。 |
j****x
发帖数: 1704 | 11 没做过酶切回收测序，因为除非特殊情况（比如长重复序列）基本上没有这个需要。但
是PCR产物回收测序算是routine这没有什么疑问吧。你们测序中心给出的解释，类比一
下，个人觉得很牵强。我专门打电话给测序公司的技术支持，人家说没有任何问题，而
且常用的qiagen等胶回收试剂盒的说明上也写得很清楚，回收后的片断可直接用于测序
反应（参考试剂盒说明或主业）。
1. 胶回收自然会影响得率，一般损失在50%以上，但是只要你能保证回收后测序模板的
浓度（一般而言20-30ng/ul足够了），就没有问题，这应该是不难办到的。大不了酶切
体系做大一点，质粒多用一点而已。
2. 胶回收过程中DNA的变性复性没有那么夸张，如果是单链DNA有可能形成不规则结构
，双链除非特殊情况，还是很稳定的，你的酶切产物和一般的PCR产物没有本质的不同
，测序上自然也没有明显的差异。建议你问问他们是不是PCR产物胶回收测序也不能做
，如果是这样的话，那就没什么可说的了，建议你送公司测序吧，你们的测序中心不靠
谱。
不知道你们那里是什么情况，反正我们这里的测序中心就是垃圾。硬件倒是很好，2台
454，2台GA，还有好几台传统3730，但是基本就没能理想的运转过。二代测序就不说了
，自己人都不建议去那里做。普通测序需要送样者自己做大量的手工工作，质量也不稳
定，相比较送测序公司，价格上甚至都没有什么优势，纯粹的摆设。测试了2次之后就
彻底放弃了，还是送公司比较靠谱，下午6点前把样品放到楼下collection box里，第
二天一早9点测序结果就发到你邮箱里了，省心省力。
链。
【在 s***o 的大作中提到】
: 谢谢大家，和测序中心几个人交流后，
: 得到一个比较合理的解释：
: 酶切会影响得率，对非high copy的plasmid影响尤其严重。
: 而gel回收在融胶时候，会有DNA的变性和复性，有的序列可能形成不规则结构比如三链。
: 估计要把insert subclone到比如 T-easy里面了。
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s***o
发帖数: 1189 | 12 谢谢兄弟了。
我的确要做长重复序列，plasmid也是又大又low copy的。测序中心说不能做是不敢保
证测出的效果；如果我们愿意，他们可以试着看，但是不关结果如何，一样要bill的。
接触的公司到是很干脆，做不出来不收钱。
可是，我要的是一个肯定的结果，花不花钱又关我什么事。
做不出来的话，浪费的是我的时间精力，带来的是老板对项目进展的不满。
最稳妥的方式，还是克隆到另外vector上，再测。项目才开始，不想有什么drama；记
得以前有个兄弟好像就是开始克隆不出来，2-3月不到就被老板叫去谈话了。
【在 j****x 的大作中提到】
: 没做过酶切回收测序，因为除非特殊情况（比如长重复序列）基本上没有这个需要。但
: 是PCR产物回收测序算是routine这没有什么疑问吧。你们测序中心给出的解释，类比一
: 下，个人觉得很牵强。我专门打电话给测序公司的技术支持，人家说没有任何问题，而
: 且常用的qiagen等胶回收试剂盒的说明上也写得很清楚，回收后的片断可直接用于测序
: 反应（参考试剂盒说明或主业）。
: 1. 胶回收自然会影响得率，一般损失在50%以上，但是只要你能保证回收后测序模板的
: 浓度（一般而言20-30ng/ul足够了），就没有问题，这应该是不难办到的。大不了酶切
: 体系做大一点，质粒多用一点而已。
: 2. 胶回收过程中DNA的变性复性没有那么夸张，如果是单链DNA有可能形成不规则结构
: ，双链除非特殊情况，还是很稳定的，你的酶切产物和一般的PCR产物没有本质的不同
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j****x
发帖数: 1704 | 13 了解你的考虑和选择
我只是从原理上回答你原本的问题，回收片段测序没有任何问题，这也是公司会这么和
你表态的原因，而不是你们测序中心表现出的那样问题重重风险大大，也有可能误导后
人。
花钱不花钱确实没啥可考虑的，不过片段测不出的，构建到质粒上也同样可很可能测不
出，序列性质决定的。至于浪费时间精力什么的，克隆到载体上一样面临着未知的风险
，尤其对于重复序列而言，如果是我我不会让事情复杂化，至少，如果真的觉得这个结
果很重要的话，两条路并进。
祝好运了
【在 s***o 的大作中提到】
: 谢谢兄弟了。
: 我的确要做长重复序列，plasmid也是又大又low copy的。测序中心说不能做是不敢保
: 证测出的效果；如果我们愿意，他们可以试着看，但是不关结果如何，一样要bill的。
: 接触的公司到是很干脆，做不出来不收钱。
: 可是，我要的是一个肯定的结果，花不花钱又关我什么事。
: 做不出来的话，浪费的是我的时间精力，带来的是老板对项目进展的不满。
: 最稳妥的方式，还是克隆到另外vector上，再测。项目才开始，不想有什么drama；记
: 得以前有个兄弟好像就是开始克隆不出来，2-3月不到就被老板叫去谈话了。
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