v**p
发帖数: 15 | 1 请教大家，把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后，western检测的时候发现分
子量大了20KD左右，有可能是啥原因？ 测序没有问题，抗体也能识别。
谢谢 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 只有一条带么？如果能看到两条带的话，很可能是mono-ubiquitinylation（18kd)
or SUMO
当然，也不能排除磷酸化
【在 v**p 的大作中提到】
: 请教大家，把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后，western检测的时候发现分
: 子量大了20KD左右，有可能是啥原因？ 测序没有问题，抗体也能识别。
: 谢谢
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v**p
发帖数: 15 | 3 只有一条带， 比正常大 大约20kd的位置，这个蛋白其它氨基酸点突变都很正常，就是
这个突变这个样子的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 只有一条带么？如果能看到两条带的话，很可能是mono-ubiquitinylation（18kd)
: or SUMO
: 当然，也不能排除磷酸化
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s**2
发帖数: 1287 | 4 说说你把啥突变成啥了？我们也学习学习
【在 v**p 的大作中提到】
: 只有一条带， 比正常大 大约20kd的位置，这个蛋白其它氨基酸点突变都很正常，就是
: 这个突变这个样子的。
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s******y
发帖数: 28562 | 5 这个就不像是posttranslational modification了，否则至少能看到主带的。
可能就是因为突变的氨基酸是带电的，所以改变了蛋白结合SDS的性质，导致
在胶里跑起来不一样。
要确认这个的话，把纯化的蛋白送去飞一下质谱MALDI-TOF看看真实分子量到底
有多大
【在 v**p 的大作中提到】
: 只有一条带， 比正常大 大约20kd的位置，这个蛋白其它氨基酸点突变都很正常，就是
: 这个突变这个样子的。
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 嗯，质谱看的分子量才靠谱，跑胶只能毛估估的。
还想到一个可能，是不是这个质粒上出现了读码框位移突变啊。不过那样的话好像抗体
应该不太可能识别。还是做个质谱先确认一下吧，比跑胶快多了。 |
v**p
发帖数: 15 | 7 看来只能这样了
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个就不像是posttranslational modification了，否则至少能看到主带的。
: 可能就是因为突变的氨基酸是带电的，所以改变了蛋白结合SDS的性质，导致
: 在胶里跑起来不一样。
: 要确认这个的话，把纯化的蛋白送去飞一下质谱MALDI-TOF看看真实分子量到底
: 有多大
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h*****t
发帖数: 1226 | 8 那也要看你的抗体是识别哪一段了...
【在 T**********t 的大作中提到】
: 嗯，质谱看的分子量才靠谱，跑胶只能毛估估的。
: 还想到一个可能，是不是这个质粒上出现了读码框位移突变啊。不过那样的话好像抗体
: 应该不太可能识别。还是做个质谱先确认一下吧，比跑胶快多了。
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p*********g
发帖数: 9527 | 9 maybe you accidentally mutated a protein splicing recognition cite, so now
you are detecting the precursor instead of the mature one? |
t******y
发帖数: 716 | 10 mono-ubiquitinylation 应该到不了18kd，ubiquitin的分子量7.6kd。
【在 s******y 的大作中提到】
: 只有一条带么？如果能看到两条带的话，很可能是mono-ubiquitinylation（18kd)
: or SUMO
: 当然，也不能排除磷酸化
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V***b
发帖数: 3419 | 11 有可能是糖基化了。你说说突变了什么，周边序列是什么。 |
s******y
发帖数: 28562 | 12 最近比较晕，别笑我啊。 呵呵。
【在 t******y 的大作中提到】
: mono-ubiquitinylation 应该到不了18kd，ubiquitin的分子量7.6kd。
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s*****r
发帖数: 223 | 13 我搭车问一个，磷酸化的功能。
我做的一个蛋白，正常情况下在核内（RNA/DNA binding protein)，我诱导细胞凋亡后
，它跑到细胞质，并且磷酸化(ser/thr)(大概10KD左右）。现在知道这个蛋白突变会引
起凋亡。
我现在在设计实验，想知道这个磷酸化的功能意义。
我是新手(应该多读点文献），
不知道磷酸化，1。跟蛋白的降解是否有关系？
2。磷酸化RNA/DNA binding protein 的功能关系？
3。其它还有啥可能
谢谢 |
s******y
发帖数: 28562 | 14 磷酸化和降解可以有间接关系，和很多蛋白的结合也可能有关系，还是和
非常非常多的通路都可能有关系， 所以很难直接推测。
一般是把磷酸化的氨基酸突变了，看看会引起什么表型，然后再推测。
可以突变成不能磷酸化的集团，或者把serine, thronine变glutamate 来
模拟磷酸化后的结果
【在 s*****r 的大作中提到】
: 我搭车问一个，磷酸化的功能。
: 我做的一个蛋白，正常情况下在核内（RNA/DNA binding protein)，我诱导细胞凋亡后
: ，它跑到细胞质，并且磷酸化(ser/thr)(大概10KD左右）。现在知道这个蛋白突变会引
: 起凋亡。
: 我现在在设计实验，想知道这个磷酸化的功能意义。
: 我是新手(应该多读点文献），
: 不知道磷酸化，1。跟蛋白的降解是否有关系？
: 2。磷酸化RNA/DNA binding protein 的功能关系？
: 3。其它还有啥可能
: 谢谢
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s*****r
发帖数: 223 | 15 thanks.
【在 s******y 的大作中提到】
: 磷酸化和降解可以有间接关系，和很多蛋白的结合也可能有关系，还是和
: 非常非常多的通路都可能有关系， 所以很难直接推测。
: 一般是把磷酸化的氨基酸突变了，看看会引起什么表型，然后再推测。
: 可以突变成不能磷酸化的集团，或者把serine, thronine变glutamate 来
: 模拟磷酸化后的结果
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b*****l
发帖数: 9499 | 16 先看是不是在 RNA level 的变化：PCR 钓出相关的 mRNA 再转 cDNA 测序看一下 mRNA
的长度和构成有没有变化，isoforms 都有哪些，是不是 splicing/modification 有
不同。有条件的话，RNA-seq 一下。
另外，有没有试试在 E. coli. 里面和原来的 gene side-by-side 地表达一下？
【在 v**p 的大作中提到】
: 请教大家，把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后，western检测的时候发现分
: 子量大了20KD左右，有可能是啥原因？ 测序没有问题，抗体也能识别。
: 谢谢
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s******y
发帖数: 28562 | 17 他这个貌似是用recombinant DNA 作的，应该不存在这个剪切的问题吧？
就算不小心引入突变后把原来的cDNA 变成了intron出现了剪切，也应该是
被剪的更小.
mRNA
【在 b*****l 的大作中提到】
: 先看是不是在 RNA level 的变化：PCR 钓出相关的 mRNA 再转 cDNA 测序看一下 mRNA
: 的长度和构成有没有变化，isoforms 都有哪些，是不是 splicing/modification 有
: 不同。有条件的话，RNA-seq 一下。
: 另外，有没有试试在 E. coli. 里面和原来的 gene side-by-side 地表达一下？
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b*****l
发帖数: 9499 | 18 我是在猜，会不会因为这个突变导致了 post-transcriptional modification 的不同
，比如说某个片段在 w.t. 的 mRNA 中被 splice 掉了，而在 mut 里则没有。估计 lz
说的 sequence 没问题是指 PCR 了一下 mut 点附近的位置的 mRNA？
另外一个可能性就是 post-translational modification。所以建议在 E.Coli. 里重
复一下 mut vs w.t. 看一看。
当然了，最直接的方法是用 MS 做个 protein sequencing -- 这个俺就更不熟了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 他这个貌似是用recombinant DNA 作的，应该不存在这个剪切的问题吧？
: 就算不小心引入突变后把原来的cDNA 变成了intron出现了剪切，也应该是
: 被剪的更小.
:
: mRNA
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s******y
发帖数: 28562 | 19 这种错误的可能性不高。
因为他们应该是直接用的cDNA, 不可能没有注意到产物比预计的短。
你说的这种错误只有在knock in 的时候才会出现。但是我不认为他们奢侈到了
不在细胞里先测试就上knock in 的地步。
除非楼主其实是用酵母作表达模型，才有这个可能性（直接上genomic Knock in)。
lz
【在 b*****l 的大作中提到】
: 我是在猜，会不会因为这个突变导致了 post-transcriptional modification 的不同
: ，比如说某个片段在 w.t. 的 mRNA 中被 splice 掉了，而在 mut 里则没有。估计 lz
: 说的 sequence 没问题是指 PCR 了一下 mut 点附近的位置的 mRNA？
: 另外一个可能性就是 post-translational modification。所以建议在 E.Coli. 里重
: 复一下 mut vs w.t. 看一看。
: 当然了，最直接的方法是用 MS 做个 protein sequencing -- 这个俺就更不熟了。
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k******0
发帖数: 1073 | |
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s********n
发帖数: 2939 | 21 我之前也遇到过，不过是在E. coli里表达的蛋白，单个氨基酸突变导致蛋白变大很多
（30 kDa，大概double），SDS-PAGE观察到的，没做western，不是主要问题就放一边
了，现在想起来，还是没想通为什么。 |
s******y
发帖数: 28562 | 22 因为SDS-PAGE其实不是看分子量的可靠方式。
蛋白在胶里跑的速度和结合的SDS的量有关，和蛋白本身的构型也有一定关系。
经典生化里粗略的认为蛋白在SDS里面变性之后都是杆状的，这个对于大部分
蛋白是对的，但是对于某些比较特殊的蛋白并不符合事实。
【在 s********n 的大作中提到】
: 我之前也遇到过，不过是在E. coli里表达的蛋白，单个氨基酸突变导致蛋白变大很多
: （30 kDa，大概double），SDS-PAGE观察到的，没做western，不是主要问题就放一边
: 了，现在想起来，还是没想通为什么。
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s********n
发帖数: 2939 | 23 呵呵，的确是这么说，只是做了这么多的突变只发现这样一个例外的确是觉得挺奇怪的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 因为SDS-PAGE其实不是看分子量的可靠方式。
: 蛋白在胶里跑的速度和结合的SDS的量有关，和蛋白本身的构型也有一定关系。
: 经典生化里粗略的认为蛋白在SDS里面变性之后都是杆状的，这个对于大部分
: 蛋白是对的，但是对于某些比较特殊的蛋白并不符合事实。
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D****g
发帖数: 275 | 24 是不是膜蛋白？如果是的话，很有可能是糖基化，可以用糖基化剪切酶十一时．
【在 v**p 的大作中提到】
: 请教大家，把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后，western检测的时候发现分
: 子量大了20KD左右，有可能是啥原因？ 测序没有问题，抗体也能识别。
: 谢谢
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t****p
发帖数: 1504 | 25 我以前也曾看到类似现象，就是一个蛋白有两带，大的用genome sequence怎么解释都
不通，比预计的条带（小带）大20kd左右，后来用sumo，磷酸化啊，糖基化啊一一检测
过去，什么都不是，现在还是不知道什么原因。
还碰到一个情况是把内源蛋白交联，发现有多一条带，大20kd左右，以为交联到了新蛋
白，质谱打了两次，除了这个蛋白序列外没有其它的。问不少人，都说构象的变化导致
20kd的迁移从来没有出现过。迄今为止还没有很让我信服的解释。
【在 v**p 的大作中提到】
: 请教大家，把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后，western检测的时候发现分
: 子量大了20KD左右，有可能是啥原因？ 测序没有问题，抗体也能识别。
: 谢谢
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f******s
发帖数: 288 | 26 能说一下你是把什么 氨基酸变成什么了么 ？ （如果结构已经出来了的话） 大体在什
么结构 region ？ 看看是不是容易被modification target的点，或者容易改变蛋白
的 folding 或者charge 的位置？
我觉得在e coli 里的表达也是一个办法，看看是不是也多了那20kd，至少可以排除
modification。
【在 v**p 的大作中提到】
: 请教大家，把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后，western检测的时候发现分
: 子量大了20KD左右，有可能是啥原因？ 测序没有问题，抗体也能识别。
: 谢谢
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v**p
发帖数: 15 | 27 谢谢大家的热烈讨论，这几天比较忙，所以没有上来
情况是这样的，我是把R突变成S，这个蛋白的结果现在还不知道，但是这个位点据坐结
构的合作实验室说很可能与该蛋白形成2聚体有关系。
【在 f******s 的大作中提到】
: 能说一下你是把什么 氨基酸变成什么了么 ？ （如果结构已经出来了的话） 大体在什
: 么结构 region ？ 看看是不是容易被modification target的点，或者容易改变蛋白
: 的 folding 或者charge 的位置？
: 我觉得在e coli 里的表达也是一个办法，看看是不是也多了那20kd，至少可以排除
: modification。
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s********n
发帖数: 2939 | 28 你不是跑的SDS-PAGE吗？理论上dimer应该不存在吧。
【在 v**p 的大作中提到】
: 谢谢大家的热烈讨论，这几天比较忙，所以没有上来
: 情况是这样的，我是把R突变成S，这个蛋白的结果现在还不知道，但是这个位点据坐结
: 构的合作实验室说很可能与该蛋白形成2聚体有关系。
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v**p
发帖数: 15 | 29 应该不可能是dimer，而且这个protein有100kd 左右
【在 s********n 的大作中提到】
: 你不是跑的SDS-PAGE吗？理论上dimer应该不存在吧。
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p********i
发帖数: 116 | |
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p********i
发帖数: 116 | 31 又查了一下，还真有phosphorylation dependent sumoylation。 |
s******s
发帖数: 13035 | 32 你们还在讨论这个啊。我来说一句，大家都在说突变了以后多修饰了，
这种可能性当然有，但是也不大。另一种可能性是突变以后少修饰了。比如
强负电的糖基化，正常蛋白虽然比较大，但是跑的快；突变蛋白少了这个修
饰，虽然小了，但是看起来更大
【在 p********i 的大作中提到】
: S磷酸化后被其他东西修饰？
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