v**p 发帖数: 15 | 1 请教大家,把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后,western检测的时候发现分
子量大了20KD左右,有可能是啥原因? 测序没有问题,抗体也能识别。
谢谢 |
s******y 发帖数: 28562 | 2 只有一条带么?如果能看到两条带的话,很可能是mono-ubiquitinylation(18kd)
or SUMO
当然,也不能排除磷酸化
【在 v**p 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请教大家,把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后,western检测的时候发现分 : 子量大了20KD左右,有可能是啥原因? 测序没有问题,抗体也能识别。 : 谢谢
|
v**p 发帖数: 15 | 3 只有一条带, 比正常大 大约20kd的位置,这个蛋白其它氨基酸点突变都很正常,就是
这个突变这个样子的。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 只有一条带么?如果能看到两条带的话,很可能是mono-ubiquitinylation(18kd) : or SUMO : 当然,也不能排除磷酸化
|
s**2 发帖数: 1287 | 4 说说你把啥突变成啥了?我们也学习学习
【在 v**p 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 只有一条带, 比正常大 大约20kd的位置,这个蛋白其它氨基酸点突变都很正常,就是 : 这个突变这个样子的。
|
s******y 发帖数: 28562 | 5 这个就不像是posttranslational modification了,否则至少能看到主带的。
可能就是因为突变的氨基酸是带电的,所以改变了蛋白结合SDS的性质,导致
在胶里跑起来不一样。
要确认这个的话,把纯化的蛋白送去飞一下质谱MALDI-TOF看看真实分子量到底
有多大
【在 v**p 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 只有一条带, 比正常大 大约20kd的位置,这个蛋白其它氨基酸点突变都很正常,就是 : 这个突变这个样子的。
|
T**********t 发帖数: 1604 | 6 嗯,质谱看的分子量才靠谱,跑胶只能毛估估的。
还想到一个可能,是不是这个质粒上出现了读码框位移突变啊。不过那样的话好像抗体
应该不太可能识别。还是做个质谱先确认一下吧,比跑胶快多了。 |
v**p 发帖数: 15 | 7 看来只能这样了
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个就不像是posttranslational modification了,否则至少能看到主带的。 : 可能就是因为突变的氨基酸是带电的,所以改变了蛋白结合SDS的性质,导致 : 在胶里跑起来不一样。 : 要确认这个的话,把纯化的蛋白送去飞一下质谱MALDI-TOF看看真实分子量到底 : 有多大
|
h*****t 发帖数: 1226 | 8 那也要看你的抗体是识别哪一段了...
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 嗯,质谱看的分子量才靠谱,跑胶只能毛估估的。 : 还想到一个可能,是不是这个质粒上出现了读码框位移突变啊。不过那样的话好像抗体 : 应该不太可能识别。还是做个质谱先确认一下吧,比跑胶快多了。
|
p*********g 发帖数: 9527 | 9 maybe you accidentally mutated a protein splicing recognition cite, so now
you are detecting the precursor instead of the mature one? |
t******y 发帖数: 716 | 10 mono-ubiquitinylation 应该到不了18kd,ubiquitin的分子量7.6kd。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 只有一条带么?如果能看到两条带的话,很可能是mono-ubiquitinylation(18kd) : or SUMO : 当然,也不能排除磷酸化
|
|
|
V***b 发帖数: 3419 | 11 有可能是糖基化了。你说说突变了什么,周边序列是什么。 |
s******y 发帖数: 28562 | 12 最近比较晕,别笑我啊。 呵呵。
【在 t******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : mono-ubiquitinylation 应该到不了18kd,ubiquitin的分子量7.6kd。
|
s*****r 发帖数: 223 | 13 我搭车问一个,磷酸化的功能。
我做的一个蛋白,正常情况下在核内(RNA/DNA binding protein),我诱导细胞凋亡后
,它跑到细胞质,并且磷酸化(ser/thr)(大概10KD左右)。现在知道这个蛋白突变会引
起凋亡。
我现在在设计实验,想知道这个磷酸化的功能意义。
我是新手(应该多读点文献),
不知道磷酸化,1。跟蛋白的降解是否有关系?
2。磷酸化RNA/DNA binding protein 的功能关系?
3。其它还有啥可能
谢谢 |
s******y 发帖数: 28562 | 14 磷酸化和降解可以有间接关系,和很多蛋白的结合也可能有关系,还是和
非常非常多的通路都可能有关系, 所以很难直接推测。
一般是把磷酸化的氨基酸突变了,看看会引起什么表型,然后再推测。
可以突变成不能磷酸化的集团,或者把serine, thronine变glutamate 来
模拟磷酸化后的结果
【在 s*****r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我搭车问一个,磷酸化的功能。 : 我做的一个蛋白,正常情况下在核内(RNA/DNA binding protein),我诱导细胞凋亡后 : ,它跑到细胞质,并且磷酸化(ser/thr)(大概10KD左右)。现在知道这个蛋白突变会引 : 起凋亡。 : 我现在在设计实验,想知道这个磷酸化的功能意义。 : 我是新手(应该多读点文献), : 不知道磷酸化,1。跟蛋白的降解是否有关系? : 2。磷酸化RNA/DNA binding protein 的功能关系? : 3。其它还有啥可能 : 谢谢
|
s*****r 发帖数: 223 | 15 thanks.
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 磷酸化和降解可以有间接关系,和很多蛋白的结合也可能有关系,还是和 : 非常非常多的通路都可能有关系, 所以很难直接推测。 : 一般是把磷酸化的氨基酸突变了,看看会引起什么表型,然后再推测。 : 可以突变成不能磷酸化的集团,或者把serine, thronine变glutamate 来 : 模拟磷酸化后的结果
|
b*****l 发帖数: 9499 | 16 先看是不是在 RNA level 的变化:PCR 钓出相关的 mRNA 再转 cDNA 测序看一下 mRNA
的长度和构成有没有变化,isoforms 都有哪些,是不是 splicing/modification 有
不同。有条件的话,RNA-seq 一下。
另外,有没有试试在 E. coli. 里面和原来的 gene side-by-side 地表达一下?
【在 v**p 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请教大家,把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后,western检测的时候发现分 : 子量大了20KD左右,有可能是啥原因? 测序没有问题,抗体也能识别。 : 谢谢
|
s******y 发帖数: 28562 | 17 他这个貌似是用recombinant DNA 作的,应该不存在这个剪切的问题吧?
就算不小心引入突变后把原来的cDNA 变成了intron出现了剪切,也应该是
被剪的更小.
mRNA
【在 b*****l 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 先看是不是在 RNA level 的变化:PCR 钓出相关的 mRNA 再转 cDNA 测序看一下 mRNA : 的长度和构成有没有变化,isoforms 都有哪些,是不是 splicing/modification 有 : 不同。有条件的话,RNA-seq 一下。 : 另外,有没有试试在 E. coli. 里面和原来的 gene side-by-side 地表达一下?
|
b*****l 发帖数: 9499 | 18 我是在猜,会不会因为这个突变导致了 post-transcriptional modification 的不同
,比如说某个片段在 w.t. 的 mRNA 中被 splice 掉了,而在 mut 里则没有。估计 lz
说的 sequence 没问题是指 PCR 了一下 mut 点附近的位置的 mRNA?
另外一个可能性就是 post-translational modification。所以建议在 E.Coli. 里重
复一下 mut vs w.t. 看一看。
当然了,最直接的方法是用 MS 做个 protein sequencing -- 这个俺就更不熟了。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 他这个貌似是用recombinant DNA 作的,应该不存在这个剪切的问题吧? : 就算不小心引入突变后把原来的cDNA 变成了intron出现了剪切,也应该是 : 被剪的更小. : : mRNA
|
s******y 发帖数: 28562 | 19 这种错误的可能性不高。
因为他们应该是直接用的cDNA, 不可能没有注意到产物比预计的短。
你说的这种错误只有在knock in 的时候才会出现。但是我不认为他们奢侈到了
不在细胞里先测试就上knock in 的地步。
除非楼主其实是用酵母作表达模型,才有这个可能性(直接上genomic Knock in)。
lz
【在 b*****l 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我是在猜,会不会因为这个突变导致了 post-transcriptional modification 的不同 : ,比如说某个片段在 w.t. 的 mRNA 中被 splice 掉了,而在 mut 里则没有。估计 lz : 说的 sequence 没问题是指 PCR 了一下 mut 点附近的位置的 mRNA? : 另外一个可能性就是 post-translational modification。所以建议在 E.Coli. 里重 : 复一下 mut vs w.t. 看一看。 : 当然了,最直接的方法是用 MS 做个 protein sequencing -- 这个俺就更不熟了。
|
k******0 发帖数: 1073 | |
|
|
s********n 发帖数: 2939 | 21 我之前也遇到过,不过是在E. coli里表达的蛋白,单个氨基酸突变导致蛋白变大很多
(30 kDa,大概double),SDS-PAGE观察到的,没做western,不是主要问题就放一边
了,现在想起来,还是没想通为什么。 |
s******y 发帖数: 28562 | 22 因为SDS-PAGE其实不是看分子量的可靠方式。
蛋白在胶里跑的速度和结合的SDS的量有关,和蛋白本身的构型也有一定关系。
经典生化里粗略的认为蛋白在SDS里面变性之后都是杆状的,这个对于大部分
蛋白是对的,但是对于某些比较特殊的蛋白并不符合事实。
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我之前也遇到过,不过是在E. coli里表达的蛋白,单个氨基酸突变导致蛋白变大很多 : (30 kDa,大概double),SDS-PAGE观察到的,没做western,不是主要问题就放一边 : 了,现在想起来,还是没想通为什么。
|
s********n 发帖数: 2939 | 23 呵呵,的确是这么说,只是做了这么多的突变只发现这样一个例外的确是觉得挺奇怪的。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 因为SDS-PAGE其实不是看分子量的可靠方式。 : 蛋白在胶里跑的速度和结合的SDS的量有关,和蛋白本身的构型也有一定关系。 : 经典生化里粗略的认为蛋白在SDS里面变性之后都是杆状的,这个对于大部分 : 蛋白是对的,但是对于某些比较特殊的蛋白并不符合事实。
|
D****g 发帖数: 275 | 24 是不是膜蛋白?如果是的话,很有可能是糖基化,可以用糖基化剪切酶十一时.
【在 v**p 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请教大家,把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后,western检测的时候发现分 : 子量大了20KD左右,有可能是啥原因? 测序没有问题,抗体也能识别。 : 谢谢
|
t****p 发帖数: 1504 | 25 我以前也曾看到类似现象,就是一个蛋白有两带,大的用genome sequence怎么解释都
不通,比预计的条带(小带)大20kd左右,后来用sumo,磷酸化啊,糖基化啊一一检测
过去,什么都不是,现在还是不知道什么原因。
还碰到一个情况是把内源蛋白交联,发现有多一条带,大20kd左右,以为交联到了新蛋
白,质谱打了两次,除了这个蛋白序列外没有其它的。问不少人,都说构象的变化导致
20kd的迁移从来没有出现过。迄今为止还没有很让我信服的解释。
【在 v**p 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请教大家,把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后,western检测的时候发现分 : 子量大了20KD左右,有可能是啥原因? 测序没有问题,抗体也能识别。 : 谢谢
|
f******s 发帖数: 288 | 26 能说一下你是把什么 氨基酸变成什么了么 ? (如果结构已经出来了的话) 大体在什
么结构 region ? 看看是不是容易被modification target的点,或者容易改变蛋白
的 folding 或者charge 的位置?
我觉得在e coli 里的表达也是一个办法,看看是不是也多了那20kd,至少可以排除
modification。
【在 v**p 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请教大家,把一个蛋白其中的一个氨基酸进行点突变之后,western检测的时候发现分 : 子量大了20KD左右,有可能是啥原因? 测序没有问题,抗体也能识别。 : 谢谢
|
v**p 发帖数: 15 | 27 谢谢大家的热烈讨论,这几天比较忙,所以没有上来
情况是这样的,我是把R突变成S,这个蛋白的结果现在还不知道,但是这个位点据坐结
构的合作实验室说很可能与该蛋白形成2聚体有关系。
【在 f******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 能说一下你是把什么 氨基酸变成什么了么 ? (如果结构已经出来了的话) 大体在什 : 么结构 region ? 看看是不是容易被modification target的点,或者容易改变蛋白 : 的 folding 或者charge 的位置? : 我觉得在e coli 里的表达也是一个办法,看看是不是也多了那20kd,至少可以排除 : modification。
|
s********n 发帖数: 2939 | 28 你不是跑的SDS-PAGE吗?理论上dimer应该不存在吧。
【在 v**p 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢大家的热烈讨论,这几天比较忙,所以没有上来 : 情况是这样的,我是把R突变成S,这个蛋白的结果现在还不知道,但是这个位点据坐结 : 构的合作实验室说很可能与该蛋白形成2聚体有关系。
|
v**p 发帖数: 15 | 29 应该不可能是dimer,而且这个protein有100kd 左右
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你不是跑的SDS-PAGE吗?理论上dimer应该不存在吧。
|
p********i 发帖数: 116 | |
|
|
p********i 发帖数: 116 | 31 又查了一下,还真有phosphorylation dependent sumoylation。 |
s******s 发帖数: 13035 | 32 你们还在讨论这个啊。我来说一句,大家都在说突变了以后多修饰了,
这种可能性当然有,但是也不大。另一种可能性是突变以后少修饰了。比如
强负电的糖基化,正常蛋白虽然比较大,但是跑的快;突变蛋白少了这个修
饰,虽然小了,但是看起来更大
【在 p********i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : S磷酸化后被其他东西修饰?
|