C*******e
发帖数: 4348 | 1 纯感慨
我猜搞生物的没几个从来没有纯化过蛋白的
纯化过蛋白却没有用过这个tag那个tag、没有用过亲和层析的又是少之又少
His-tag，GST-tag等等真是大大方便了重组蛋白的提纯
很少再需要old school的技术
提纯蛋白变得不那么tricky
但是。。。。。
最近反思有点太过依赖于这些tag
有的时候没有能够充分利用蛋白本身的特性
因为有tag嘛
用差不多千篇一律的提纯步骤就好啦
不过要有些微调而已
手上在做的一个蛋白
比较大，高pI
以前大家都是加tag做
His-，GST-，intein-
放N端，放C端。。。。
产量低
容易沉淀出来
折腾半天也折腾不出来多少
一直被定性为比较麻烦难搞的蛋白
最近因为别的原因改了一下纯化流程
加了一个阳离子交换的步骤作为粗提
然后再亲和层析
结果出乎意料的好
蛋白浓缩到17mg/ml都没有沉淀的迹象
回头想想太依赖于亲和层析真是走了不少弯路呢
特此感慨 |
W*****o
发帖数: 1780 | 2 说实话，我对于加了tag的蛋白基本是不信任的，因为加了tag之后功能如何，结构如何
谁都说不准会有什么变化。
我老板就曾经专门写信给editor,如果是加了tag纯化出来的蛋白，他拒绝reveiw，这类
文章也不要再请他来审稿了。否则寄来了，也是据。 |
s******y
发帖数: 28562 | 3 那也太狠了。
很多蛋白不加tag 很难富集和提纯的。
当然，单纯的蛋白生化数据之外还应该有基因层次上的数据(KO, KD)之类。
纯粹的排斥所有tag就有点过分old school 了
【在 W*****o 的大作中提到】
: 说实话，我对于加了tag的蛋白基本是不信任的，因为加了tag之后功能如何，结构如何
: 谁都说不准会有什么变化。
: 我老板就曾经专门写信给editor,如果是加了tag纯化出来的蛋白，他拒绝reveiw，这类
: 文章也不要再请他来审稿了。否则寄来了，也是据。
|
W*****o
发帖数: 1780 | 4 没说清楚，我说的是针对我们领域的蛋白。已经有很好的不用加tag可以完全纯化到和
自然蛋白结构、功能一样的蛋白。但很多组偷懒怕麻烦去用传统的tag,从包涵体沉淀、
复性的办法。这样得出的结果我们肯定没法相信。
当然对于一些还没有成熟办法纯化的蛋白用tag什么的无可厚非。
【在 s******y 的大作中提到】
: 那也太狠了。
: 很多蛋白不加tag 很难富集和提纯的。
: 当然，单纯的蛋白生化数据之外还应该有基因层次上的数据(KO, KD)之类。
: 纯粹的排斥所有tag就有点过分old school 了
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s******y
发帖数: 28562 | 5 哦，那还比较合理。
【在 W*****o 的大作中提到】
: 没说清楚，我说的是针对我们领域的蛋白。已经有很好的不用加tag可以完全纯化到和
: 自然蛋白结构、功能一样的蛋白。但很多组偷懒怕麻烦去用传统的tag,从包涵体沉淀、
: 复性的办法。这样得出的结果我们肯定没法相信。
: 当然对于一些还没有成熟办法纯化的蛋白用tag什么的无可厚非。
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b******n
发帖数: 4225 | 6 呵呵，这个得看如何对待
比如说NIH已经不会fund纯粹测序的proposal
有些人还认为还要研究验证蛋白功能干什么，都可以annotate出来了
【在 C*******e 的大作中提到】
: 纯感慨
: 我猜搞生物的没几个从来没有纯化过蛋白的
: 纯化过蛋白却没有用过这个tag那个tag、没有用过亲和层析的又是少之又少
: His-tag，GST-tag等等真是大大方便了重组蛋白的提纯
: 很少再需要old school的技术
: 提纯蛋白变得不那么tricky
: 但是。。。。。
: 最近反思有点太过依赖于这些tag
: 有的时候没有能够充分利用蛋白本身的特性
: 因为有tag嘛
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s********n
发帖数: 2939 | 7 这个先富集的方法在工业上用的很普遍的，只是实验室对效率要求不高，只要得到蛋白
就可以了，所以一般都先过affinity column。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 纯感慨
: 我猜搞生物的没几个从来没有纯化过蛋白的
: 纯化过蛋白却没有用过这个tag那个tag、没有用过亲和层析的又是少之又少
: His-tag，GST-tag等等真是大大方便了重组蛋白的提纯
: 很少再需要old school的技术
: 提纯蛋白变得不那么tricky
: 但是。。。。。
: 最近反思有点太过依赖于这些tag
: 有的时候没有能够充分利用蛋白本身的特性
: 因为有tag嘛
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m******5
发帖数: 1383 | 8 也来凑个热闹问个问题
+Tag的情况下大家喜欢加Poly glycine linker么？
有的说法是+ Linker可以minimize Tag的side effect
但实际上+linker的人似乎也不多…… |
x*****o
发帖数: 441 | 9 一直对于从包涵体里面提纯蛋白感兴趣. 是不是这样做不好? 我们组里面提纯的蛋白就
算是可溶性的也用non native的方法纯化,就是6M Urea denature,然后ion exchange
FPLC, 然后再dialysis. 所以最后都用包涵体了.
是不是用ion exchange 必须denature阿?
【在 W*****o 的大作中提到】
: 没说清楚，我说的是针对我们领域的蛋白。已经有很好的不用加tag可以完全纯化到和
: 自然蛋白结构、功能一样的蛋白。但很多组偷懒怕麻烦去用传统的tag,从包涵体沉淀、
: 复性的办法。这样得出的结果我们肯定没法相信。
: 当然对于一些还没有成熟办法纯化的蛋白用tag什么的无可厚非。
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C*******e
发帖数: 4348 | 10 那还比较靠谱
光看第一个回复觉得很狠
对于纯偷懒的是应该打击一下
呵呵
【在 W*****o 的大作中提到】
: 没说清楚，我说的是针对我们领域的蛋白。已经有很好的不用加tag可以完全纯化到和
: 自然蛋白结构、功能一样的蛋白。但很多组偷懒怕麻烦去用传统的tag,从包涵体沉淀、
: 复性的办法。这样得出的结果我们肯定没法相信。
: 当然对于一些还没有成熟办法纯化的蛋白用tag什么的无可厚非。
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C*******e
发帖数: 4348 | 11 是啊
但正因为这样有的时候不是件好事
就像我的这个蛋白
如果我没有改protocol
可能永远也拿不到这么多高纯度而且不会沉淀出来的蛋白
【在 s********n 的大作中提到】
: 这个先富集的方法在工业上用的很普遍的，只是实验室对效率要求不高，只要得到蛋白
: 就可以了，所以一般都先过affinity column。
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C*******e
发帖数: 4348 | 12 谁说ion exchange必须要denature的？！
你们组里面很奇怪啊
一般而言denature然后refolding是下下策
是没有办法时候的办法啊
怎么还有人把不是包涵体的，可溶的蛋白特别变了性纯化呢？
不太明白
【在 x*****o 的大作中提到】
: 一直对于从包涵体里面提纯蛋白感兴趣. 是不是这样做不好? 我们组里面提纯的蛋白就
: 算是可溶性的也用non native的方法纯化,就是6M Urea denature,然后ion exchange
: FPLC, 然后再dialysis. 所以最后都用包涵体了.
: 是不是用ion exchange 必须denature阿?
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x*****o
发帖数: 441 | 13 这个我也不明白,所以想乘机问问.
因为是提纯一个系列ribosomal protein, 有的可溶有的不溶. 不知道是不是图省事,都
是一个方法纯化,或者没有更好的纯化方法? 实验室传下来的protocol 就是这样的.因
为我是新来的,所以也不知道原委.
实验室的有人说是包含体提出来的比较纯.所以即使可溶,也加长express 的时间,push
protein to inclusion body. 这样做是不是不好呢?
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谁说ion exchange必须要denature的？！
: 你们组里面很奇怪啊
: 一般而言denature然后refolding是下下策
: 是没有办法时候的办法啊
: 怎么还有人把不是包涵体的，可溶的蛋白特别变了性纯化呢？
: 不太明白
|
e****s
发帖数: 1125 | 14 像楼上说的，一般有可溶的就从可溶的里面提。
但你的Case比较特别点。关键是活性，只要蛋白有很好的活性就不管怎么提的了。
我提蛋白的第一原则：If it works, don't bother to change anything.
Inclusion body 提出来的纯一些可能和目标蛋白在包涵体里的比重高有关系。
push
【在 x*****o 的大作中提到】
: 这个我也不明白,所以想乘机问问.
: 因为是提纯一个系列ribosomal protein, 有的可溶有的不溶. 不知道是不是图省事,都
: 是一个方法纯化,或者没有更好的纯化方法? 实验室传下来的protocol 就是这样的.因
: 为我是新来的,所以也不知道原委.
: 实验室的有人说是包含体提出来的比较纯.所以即使可溶,也加长express 的时间,push
: protein to inclusion body. 这样做是不是不好呢?
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g*****p
发帖数: 451 | 15 你这个结果没办法自圆其说
你用阳离子再用亲和
和先用亲和有啥区别
原来纯化出来的容易沉淀，现在的就不沉淀了？
我想你还是得把原因搞明白才行
除非你的蛋白本身要么是什么核酸结合造成溶解性降低
要么结合了其他乱七八糟的东西导致这个结果
你用离子交换的的时候不小心把这些组分去掉了
不过这个可能性很低了
你这个实验结果太可疑了
【在 C*******e 的大作中提到】
: 纯感慨
: 我猜搞生物的没几个从来没有纯化过蛋白的
: 纯化过蛋白却没有用过这个tag那个tag、没有用过亲和层析的又是少之又少
: His-tag，GST-tag等等真是大大方便了重组蛋白的提纯
: 很少再需要old school的技术
: 提纯蛋白变得不那么tricky
: 但是。。。。。
: 最近反思有点太过依赖于这些tag
: 有的时候没有能够充分利用蛋白本身的特性
: 因为有tag嘛
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e****s
发帖数: 1125 | 16 说实话，通常一个没Tag的蛋白，弄一个纯化流程也还是要相当的时间和精力的。
我就化了半年时间提一个蛋白。表达不好，3个柱子跑得痛苦啊。
【在 W*****o 的大作中提到】
: 说实话，我对于加了tag的蛋白基本是不信任的，因为加了tag之后功能如何，结构如何
: 谁都说不准会有什么变化。
: 我老板就曾经专门写信给editor,如果是加了tag纯化出来的蛋白，他拒绝reveiw，这类
: 文章也不要再请他来审稿了。否则寄来了，也是据。
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g*****p
发帖数: 451 | 17 没见过这么说话的，这根本也不是严谨的科研态度
人家用了tag纯化也好，refolding也好，只要达到对应的功能指标
有啥不可信的？
结构有没有变化又不是凭空乱猜的
况且绝大多数用tag帮助解析了结构的蛋白和untagged的蛋白结构的比较显示
也没见有啥大的差异
【在 W*****o 的大作中提到】
: 说实话，我对于加了tag的蛋白基本是不信任的，因为加了tag之后功能如何，结构如何
: 谁都说不准会有什么变化。
: 我老板就曾经专门写信给editor,如果是加了tag纯化出来的蛋白，他拒绝reveiw，这类
: 文章也不要再请他来审稿了。否则寄来了，也是据。
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C*******e
发帖数: 4348 | 18 我是觉得把可溶的也denature比较不可思议
至于包涵体
我觉得很有可能大量表达的时候在细胞里就是局部浓度超级高的
不管后面提纯的时候蛋白表现出来的是可溶还是不可溶
很多时候发现蛋白不可溶
然后就归结为包涵体的有点太笼统的
很多情况下其实跟如何破碎细胞
还有是如何提纯的有很大关系
我就遇到过多次普通protocol下破细胞后不可溶的蛋白（离心后在沉淀里）
换别的提纯方法最后发现其实是可溶的（在上清里）
push
【在 x*****o 的大作中提到】
: 这个我也不明白,所以想乘机问问.
: 因为是提纯一个系列ribosomal protein, 有的可溶有的不溶. 不知道是不是图省事,都
: 是一个方法纯化,或者没有更好的纯化方法? 实验室传下来的protocol 就是这样的.因
: 为我是新来的,所以也不知道原委.
: 实验室的有人说是包含体提出来的比较纯.所以即使可溶,也加长express 的时间,push
: protein to inclusion body. 这样做是不是不好呢?
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x*****o
发帖数: 441 | 19 我在表达有的可溶蛋白的时候可能是浓度太高,也形成包涵体,但是我用supernant纯化
产率也不错. 但是这个蛋白是带his-tag的.其他的蛋白不管可不可溶都没有tag,可能提
纯有问题.
想问一下是通过破碎细胞和提纯办法使好像不溶的蛋白可溶的?
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我是觉得把可溶的也denature比较不可思议
: 至于包涵体
: 我觉得很有可能大量表达的时候在细胞里就是局部浓度超级高的
: 不管后面提纯的时候蛋白表现出来的是可溶还是不可溶
: 很多时候发现蛋白不可溶
: 然后就归结为包涵体的有点太笼统的
: 很多情况下其实跟如何破碎细胞
: 还有是如何提纯的有很大关系
: 我就遇到过多次普通protocol下破细胞后不可溶的蛋白（离心后在沉淀里）
: 换别的提纯方法最后发现其实是可溶的（在上清里）
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g*****p
发帖数: 451 | 20 你说的完全是两个不同的东西
inclusion body通常是蛋白在开始fold的时候就没对，然后疏水区捣腾到一块去，这个
时候沉淀下来的东西是misfold的，这个玩意加点一般的溶剂没法溶解
蛋白沉淀有时候只是盐析或是过饱和，这种情况加点溶剂说不定还能溶解
比如给本科生做的硫酸铵分级沉淀提纯蛋白实验
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我是觉得把可溶的也denature比较不可思议
: 至于包涵体
: 我觉得很有可能大量表达的时候在细胞里就是局部浓度超级高的
: 不管后面提纯的时候蛋白表现出来的是可溶还是不可溶
: 很多时候发现蛋白不可溶
: 然后就归结为包涵体的有点太笼统的
: 很多情况下其实跟如何破碎细胞
: 还有是如何提纯的有很大关系
: 我就遇到过多次普通protocol下破细胞后不可溶的蛋白（离心后在沉淀里）
: 换别的提纯方法最后发现其实是可溶的（在上清里）
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C*******e
发帖数: 4348 | 21 我就是说现象
“你用阳离子再用亲和和先用亲和有啥区别”
——事实是，我这个例子里，就是有区别
“原来纯化出来的容易沉淀，现在的就不沉淀了？”
——就是这样
“除非你的蛋白本身要么是什么核酸结合造成溶解性降低
要么结合了其他乱七八糟的东西导致这个结果
你用离子交换的的时候不小心把这些组分去掉了”
——我觉得就是这样的，离子交换的时候去掉了一些东西，
结果我的蛋白高浓度下也不沉淀了
而且我还真的觉得我这个蛋白和核酸结合了
因为以前遇到过光是亲和层析的时候纯化出来的蛋白UV reading超级高
但是跑胶一看蛋白浓度却非常低的情况
现在也有在做这个方面后续的实验
【在 g*****p 的大作中提到】
: 你这个结果没办法自圆其说
: 你用阳离子再用亲和
: 和先用亲和有啥区别
: 原来纯化出来的容易沉淀，现在的就不沉淀了？
: 我想你还是得把原因搞明白才行
: 除非你的蛋白本身要么是什么核酸结合造成溶解性降低
: 要么结合了其他乱七八糟的东西导致这个结果
: 你用离子交换的的时候不小心把这些组分去掉了
: 不过这个可能性很低了
: 你这个实验结果太可疑了
|
n***w
发帖数: 2405 | 22 re 这个。
仍然在纯化蛋白的路上艰辛的走着。。。
lol
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我是觉得把可溶的也denature比较不可思议
: 至于包涵体
: 我觉得很有可能大量表达的时候在细胞里就是局部浓度超级高的
: 不管后面提纯的时候蛋白表现出来的是可溶还是不可溶
: 很多时候发现蛋白不可溶
: 然后就归结为包涵体的有点太笼统的
: 很多情况下其实跟如何破碎细胞
: 还有是如何提纯的有很大关系
: 我就遇到过多次普通protocol下破细胞后不可溶的蛋白（离心后在沉淀里）
: 换别的提纯方法最后发现其实是可溶的（在上清里）
|
g*****p
发帖数: 451 | 23 那说明你们原来就没仔仔细细把这个蛋白的性质好好记录过
要是核酸造成的，你们早该纯化的时候加点核酸酶
或是在用亲和层析之前用个4-5M NaCl洗洗干净，把这些细胞里
的非特异性核酸洗干净了
不然一浓缩不沉淀才怪
不过我对你的结果还是持观望态度
如果你今天刚拿到实验结果，那还是放两天再看看你的蛋白稳定不稳定吧
一般来说，还是悬
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我就是说现象
: “你用阳离子再用亲和和先用亲和有啥区别”
: ——事实是，我这个例子里，就是有区别
: “原来纯化出来的容易沉淀，现在的就不沉淀了？”
: ——就是这样
: “除非你的蛋白本身要么是什么核酸结合造成溶解性降低
: 要么结合了其他乱七八糟的东西导致这个结果
: 你用离子交换的的时候不小心把这些组分去掉了”
: ——我觉得就是这样的，离子交换的时候去掉了一些东西，
: 结果我的蛋白高浓度下也不沉淀了
|
C*******e
发帖数: 4348 | 24 也不是所有时候都能把某种方法下不可溶的蛋白变成另一种方法下可溶的
还是要看蛋白的
我只是举个例子说明，所谓“包涵体”不能跟“蛋白不可溶”画等号
我觉得大量过表达外源蛋白的时候
E.coli要那么些蛋白也没有用
也不知道该把它们怎么办
结果就都堆在一起
局部浓度很高
电镜下看就成了“包涵体”
【在 x*****o 的大作中提到】
: 我在表达有的可溶蛋白的时候可能是浓度太高,也形成包涵体,但是我用supernant纯化
: 产率也不错. 但是这个蛋白是带his-tag的.其他的蛋白不管可不可溶都没有tag,可能提
: 纯有问题.
: 想问一下是通过破碎细胞和提纯办法使好像不溶的蛋白可溶的?
|
n***w
发帖数: 2405 | 25 搭车问一下，
1、有用过GST magnetic beads的吗？有的话给推荐个～
2、发现蛋白和agarose beads interaction，有啥办法把蛋白洗出来不？
谢谢。 |
e****s
发帖数: 1125 | 26 最后那句话怎么理解？
【在 b******n 的大作中提到】
: 呵呵，这个得看如何对待
: 比如说NIH已经不会fund纯粹测序的proposal
: 有些人还认为还要研究验证蛋白功能干什么，都可以annotate出来了
|
C*******e
发帖数: 4348 | 27 “亲和层析之前用个4-5M NaCl洗洗干净”
——请教一下，这是什么意思？
是说用4-5M NaCl把亲和层析柱洗洗么？
另外，以前做这个蛋白的时候一般我们都不用UV来读浓度的
做亲和层析也用的gravity column
不是用的FPLC，有UV monitor
浓度都是做bradford或者BCA来测
所以没有观察到不寻常的UV
我不觉得这个应该归结为“没仔仔细细把这个蛋白的性质好好记录过”
【在 g*****p 的大作中提到】
: 那说明你们原来就没仔仔细细把这个蛋白的性质好好记录过
: 要是核酸造成的，你们早该纯化的时候加点核酸酶
: 或是在用亲和层析之前用个4-5M NaCl洗洗干净，把这些细胞里
: 的非特异性核酸洗干净了
: 不然一浓缩不沉淀才怪
: 不过我对你的结果还是持观望态度
: 如果你今天刚拿到实验结果，那还是放两天再看看你的蛋白稳定不稳定吧
: 一般来说，还是悬
|
e****s
发帖数: 1125 | 28 1.没用过，不知道
2.什么意思？目的蛋白还是杂蛋白结合的agarose beads(Glutathione-agarose?)?目的
蛋白结合太紧？洗不下来？
【在 n***w 的大作中提到】
: 搭车问一下，
: 1、有用过GST magnetic beads的吗？有的话给推荐个～
: 2、发现蛋白和agarose beads interaction，有啥办法把蛋白洗出来不？
: 谢谢。
|
g*****p
发帖数: 451 | 29 核酸和蛋白质的结合可以用高盐来打开
因为大部分核酸和蛋白结合都是些静电相互作用
所以你在做亲和层析之前可以加上高盐再用柱子纯化
蛋白质纯化了以后一般还是用UV测一下，因为这是检测核酸污染最简单的办法
连跑个琼脂糖胶都没这个简单
毕竟纯化的蛋白有可能有核酸污染，结合脂类
糖基化或是磷酸化
不是说你用个蛋白胶跑跑发现一条带了就叫提纯了的
而且一般来说蛋白质浓度测定用个紫外光吸收是最简单的办法
只要有芳香族氨基酸，就基本可以用这个办法测定
而且理论值一般都还蛮准的，稍微换算一下就行了
况且大部分的人纯化蛋白对蛋白浓度只要有个相对值就可以了
只要不是测定一些酶学实验或是ITC这些常数测定，一般也不需要那么关心到底蛋白浓度
是多少
【在 C*******e 的大作中提到】
: “亲和层析之前用个4-5M NaCl洗洗干净”
: ——请教一下，这是什么意思？
: 是说用4-5M NaCl把亲和层析柱洗洗么？
: 另外，以前做这个蛋白的时候一般我们都不用UV来读浓度的
: 做亲和层析也用的gravity column
: 不是用的FPLC，有UV monitor
: 浓度都是做bradford或者BCA来测
: 所以没有观察到不寻常的UV
: 我不觉得这个应该归结为“没仔仔细细把这个蛋白的性质好好记录过”
|
C*******e
发帖数: 4348 | 30 你跟我说的才是不同的东西
我不是说加点溶剂什么的就溶解了
我是说当纯化一个蛋白的时候发现不在crude extract里在pellet的时候
不能笼统的归结为是因为“inclusion body”
有时候是纯化方法不合适
当然，蛋白一开始就没有正常折叠也会是一个可能
另外我觉得“inclusion body”的定义有待商榷
如果把E. coli里过表达的蛋白局部浓度过高的现象都叫“inclusion body”的话
那很多情况下那些蛋白根本就不是misfold的
“inclusion body通常是蛋白在开始fold的时候就没对，然后疏水区捣腾到一块去”
——这其实是一个从实验现象出发的推测
如果给你一个电镜照片
下面的这个，这是inclusion body
不过如果过表达蛋白是可溶的，然后也拿去做个电镜，说不定看起来是一样的
只是没有人这么无聊去做这样的电镜而已
【在 g*****p 的大作中提到】
: 你说的完全是两个不同的东西
: inclusion body通常是蛋白在开始fold的时候就没对，然后疏水区捣腾到一块去，这个
: 时候沉淀下来的东西是misfold的，这个玩意加点一般的溶剂没法溶解
: 蛋白沉淀有时候只是盐析或是过饱和，这种情况加点溶剂说不定还能溶解
: 比如给本科生做的硫酸铵分级沉淀提纯蛋白实验
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l*********s
发帖数: 5409 | 31 I don't believe you can get natural configuration by refolding.
【在 W*****o 的大作中提到】
: 没说清楚，我说的是针对我们领域的蛋白。已经有很好的不用加tag可以完全纯化到和
: 自然蛋白结构、功能一样的蛋白。但很多组偷懒怕麻烦去用传统的tag,从包涵体沉淀、
: 复性的办法。这样得出的结果我们肯定没法相信。
: 当然对于一些还没有成熟办法纯化的蛋白用tag什么的无可厚非。
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l*********s
发帖数: 5409 | 32 正解
【在 g*****p 的大作中提到】
: 核酸和蛋白质的结合可以用高盐来打开
: 因为大部分核酸和蛋白结合都是些静电相互作用
: 所以你在做亲和层析之前可以加上高盐再用柱子纯化
: 蛋白质纯化了以后一般还是用UV测一下，因为这是检测核酸污染最简单的办法
: 连跑个琼脂糖胶都没这个简单
: 毕竟纯化的蛋白有可能有核酸污染，结合脂类
: 糖基化或是磷酸化
: 不是说你用个蛋白胶跑跑发现一条带了就叫提纯了的
: 而且一般来说蛋白质浓度测定用个紫外光吸收是最简单的办法
: 只要有芳香族氨基酸，就基本可以用这个办法测定
|
C*******e
发帖数: 4348 | 33 学习了
另外用不用UV来粗测蛋白浓度只能说是每个实验室的习惯不同
不过我以后会用这个方法检测核酸污染
另外用紫外光吸收测浓度还是能差不少的
我今天刚遇到个例子
紫外测好了以后用Extinction coefficient算出来的
跟用BCA测出来的相差了一倍
所以我个人习惯还是不喜欢依赖紫外光吸收测浓度
【在 g*****p 的大作中提到】
: 核酸和蛋白质的结合可以用高盐来打开
: 因为大部分核酸和蛋白结合都是些静电相互作用
: 所以你在做亲和层析之前可以加上高盐再用柱子纯化
: 蛋白质纯化了以后一般还是用UV测一下，因为这是检测核酸污染最简单的办法
: 连跑个琼脂糖胶都没这个简单
: 毕竟纯化的蛋白有可能有核酸污染，结合脂类
: 糖基化或是磷酸化
: 不是说你用个蛋白胶跑跑发现一条带了就叫提纯了的
: 而且一般来说蛋白质浓度测定用个紫外光吸收是最简单的办法
: 只要有芳香族氨基酸，就基本可以用这个办法测定
|
S*********s
发帖数: 304 | 34 re
【在 g*****p 的大作中提到】
: 没见过这么说话的，这根本也不是严谨的科研态度
: 人家用了tag纯化也好，refolding也好，只要达到对应的功能指标
: 有啥不可信的？
: 结构有没有变化又不是凭空乱猜的
: 况且绝大多数用tag帮助解析了结构的蛋白和untagged的蛋白结构的比较显示
: 也没见有啥大的差异
|
g*****p
发帖数: 451 | 35 你没明白我的point的，不过无所谓了，这个我不纠缠
不过你给的电镜照片可说明不了任何问题
你给的这个照片是负染吗？我看这分辨率估计也得快几十到几百nm了吧
misfold的蛋白和局部浓度过高沉淀到一块的怎么你也得几十埃的
分辨率才好指认吧
否者那不怎么看都一样的么
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你跟我说的才是不同的东西
: 我不是说加点溶剂什么的就溶解了
: 我是说当纯化一个蛋白的时候发现不在crude extract里在pellet的时候
: 不能笼统的归结为是因为“inclusion body”
: 有时候是纯化方法不合适
: 当然，蛋白一开始就没有正常折叠也会是一个可能
: 另外我觉得“inclusion body”的定义有待商榷
: 如果把E. coli里过表达的蛋白局部浓度过高的现象都叫“inclusion body”的话
: 那很多情况下那些蛋白根本就不是misfold的
: “inclusion body通常是蛋白在开始fold的时候就没对，然后疏水区捣腾到一块去”
|
n***w
发帖数: 2405 | 36 okay, 大概是这样的，
thrombin切后，离心，此上清为eluate 1, 然后再用cold 1x pbs洗4次，跑胶，发现没
有目的条带，几乎所有目的条带都
是在最后beads fraction里。怀疑是目的蛋白本身和beads结合，而不光光是通过GST－
GSH结合。
然后用reduced GSH换出GST，然后用1M NaCl洗beads，希望能够破坏蛋白和beads间的
作用，但是没用诶。。。
所以我想要不要试试magnetic beads。。。
【在 e****s 的大作中提到】
: 1.没用过，不知道
: 2.什么意思？目的蛋白还是杂蛋白结合的agarose beads(Glutathione-agarose?)?目的
: 蛋白结合太紧？洗不下来？
|
C*******e
发帖数: 4348 | 37 “misfold的蛋白和局部浓度过高沉淀到一块的怎么你也得几十埃的
分辨率才好指认吧
否者那不怎么看都一样的么”
——纯好奇，有人做这个研究看有什么不同么？
我是真的很想知道
只是现在如果遇到纯化问题
就说是因为inclusion body
当然也不会专门做电镜验证是成包涵体了
毕竟那不是纯化蛋白的目的
不解决问题
【在 g*****p 的大作中提到】
: 你没明白我的point的，不过无所谓了，这个我不纠缠
: 不过你给的电镜照片可说明不了任何问题
: 你给的这个照片是负染吗？我看这分辨率估计也得快几十到几百nm了吧
: misfold的蛋白和局部浓度过高沉淀到一块的怎么你也得几十埃的
: 分辨率才好指认吧
: 否者那不怎么看都一样的么
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C*******e
发帖数: 4348 | 38 还想请教一下
你说的高盐浓度下做亲和层析
是“4-5M”么？
在lysis buffer里就放4-5 M的NaCl？
我这个蛋白上GST柱子以后居然resin会变成一块一块的
柱子上切了以后resin又变回可以均匀悬浮的状态
请问这是什么原因啊？
【在 g*****p 的大作中提到】
: 你没明白我的point的，不过无所谓了，这个我不纠缠
: 不过你给的电镜照片可说明不了任何问题
: 你给的这个照片是负染吗？我看这分辨率估计也得快几十到几百nm了吧
: misfold的蛋白和局部浓度过高沉淀到一块的怎么你也得几十埃的
: 分辨率才好指认吧
: 否者那不怎么看都一样的么
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e****s
发帖数: 1125 | 39 乱猜一下，感觉这个更像是蛋白在Beads上Denature了。
你说的“最后Beads fraction”是用SDS之类的变形溶液洗下来的吗？还是GSH洗下来的
？都被Thrombin切开了（有没有试过GST elute下来以后再切？我猜你是在Beads上切的
）？
【在 n***w 的大作中提到】
: okay, 大概是这样的，
: thrombin切后，离心，此上清为eluate 1, 然后再用cold 1x pbs洗4次，跑胶，发现没
: 有目的条带，几乎所有目的条带都
: 是在最后beads fraction里。怀疑是目的蛋白本身和beads结合，而不光光是通过GST－
: GSH结合。
: 然后用reduced GSH换出GST，然后用1M NaCl洗beads，希望能够破坏蛋白和beads间的
: 作用，但是没用诶。。。
: 所以我想要不要试试magnetic beads。。。
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n***w
发帖数: 2405 | 40 额，为什么会denature呢？
最后跑胶用的那个beads就是直接吸出来的，是在pbs里的。
至少95％被切开了。
我没有试过先用reduced GSH先洗，然后在solution里切过，我明儿个试试。
谢谢。
【在 e****s 的大作中提到】
: 乱猜一下，感觉这个更像是蛋白在Beads上Denature了。
: 你说的“最后Beads fraction”是用SDS之类的变形溶液洗下来的吗？还是GSH洗下来的
: ？都被Thrombin切开了（有没有试过GST elute下来以后再切？我猜你是在Beads上切的
: ）？
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e****s
发帖数: 1125 | 41 蛋白死在柱子上太多了。
不管什么柱子，你把蛋白洗脱以后，用Sample Buffer泡一下Beads，都会有一定的目的
蛋白残留在里面，这些蛋白很难被正常洗脱，死在Beads上了。
GST tag溶解性增加，去Tag后可能更不稳定，甚至有什么Soluable inclusion body的
说法。GST非要切掉吗？
【在 n***w 的大作中提到】
: 额，为什么会denature呢？
: 最后跑胶用的那个beads就是直接吸出来的，是在pbs里的。
: 至少95％被切开了。
: 我没有试过先用reduced GSH先洗，然后在solution里切过，我明儿个试试。
: 谢谢。
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n***w
发帖数: 2405 | 42 额，这样阿。
前面也有个前辈说我的情况可能是出现了soluble aggregates。
嗯。GST是一定要切掉的。。。
看来真得换载体阿。。。
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【在 e****s 的大作中提到】
: 蛋白死在柱子上太多了。
: 不管什么柱子，你把蛋白洗脱以后，用Sample Buffer泡一下Beads，都会有一定的目的
: 蛋白残留在里面，这些蛋白很难被正常洗脱，死在Beads上了。
: GST tag溶解性增加，去Tag后可能更不稳定，甚至有什么Soluable inclusion body的
: 说法。GST非要切掉吗？
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C*******e
发帖数: 4348 | 43 这个现象很有意思哈
为什么蛋白在柱子上变性了反而不容易被洗下来？
soluble aggregation是什么意思？
【在 e****s 的大作中提到】
: 蛋白死在柱子上太多了。
: 不管什么柱子，你把蛋白洗脱以后，用Sample Buffer泡一下Beads，都会有一定的目的
: 蛋白残留在里面，这些蛋白很难被正常洗脱，死在Beads上了。
: GST tag溶解性增加，去Tag后可能更不稳定，甚至有什么Soluable inclusion body的
: 说法。GST非要切掉吗？
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e****s
发帖数: 1125 | 44 可能我前面说每个柱子，有点夸张，但我提的几个蛋白都有类似现象。
这篇是讲MBP tag的，GST我不知道有没有类似现象。基本就是目标蛋白misfolding了，
但Soluable 的MBP让这些蛋白并不仍然可溶。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11570842
【在 C*******e 的大作中提到】
: 这个现象很有意思哈
: 为什么蛋白在柱子上变性了反而不容易被洗下来？
: soluble aggregation是什么意思？
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X******n
发帖数: 914 | 45 Protein precipitation is basically the removal of proteins from solution.
This can be achieved in many ways including the addition salt, which takes
away the water molecules surrounding proteins in solution (as the salt
concentration increases, more water molecules associate with the salt ions
instead of the proteins) and as a result the protein molecules come together
since less water is present between them. From this simple definition you
can generalize that protein precipitation does not imply changes in protein
folding (although this is not entirely true since some protein precipitation
methods do include changes in protein folding)
Protein aggregation on the other hand is directly linked to protein mis-
folding (lack of folding) and to a great extent it is believed not to be
reversible (although there are tricks to get protein aggregates to go into
solution). Protein aggregation is to a great extent a result of an unnatural
(disease) state for the protein, like in the case of proteins being over-
expressed for research or drug development, or diseased like prions.
Insoluble aggregate are what we typically think of as protein aggregates.
They are easy to think of because they show up as precipitates (a nice and
obvious solid that comes out of solution). An soluble aggregate on the other
hand is harder to visualize. By the nature of some peptides (proteins),
even when the protein is mis-folded it may still remain in solution. That is
a soluble aggregate: a mis-folded protein that does not come out of
solution for one of many reasons: small enough that it does not precipitate,
highly hydrophilic, low enough concentration, etc.
Size is one of the consideration, but another that is as important if not
more is the hydrophilicity of the peptide.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 这个现象很有意思哈
: 为什么蛋白在柱子上变性了反而不容易被洗下来？
: soluble aggregation是什么意思？
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n***w
发帖数: 2405 | 46 谢谢了。。。
再问个问题，我如果变性提蛋白，是不是refold以后才能再bind to beads？
【在 e****s 的大作中提到】
: 可能我前面说每个柱子，有点夸张，但我提的几个蛋白都有类似现象。
: 这篇是讲MBP tag的，GST我不知道有没有类似现象。基本就是目标蛋白misfolding了，
: 但Soluable 的MBP让这些蛋白并不仍然可溶。
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11570842
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T**********t
发帖数: 1604 | 47 UV测蛋白浓度比BCA并不会特别不准，本质上都是吸收光谱嘛。
相反，因为UV测浓度不需要pipetting，不需要加特殊reagent，比BCA assay什么更便
捷，而且珍贵样品还可以回收。一般如果蛋白有紫外吸收，都可以用UV测浓度。
但是实际操作上，确实会有用计算出来的extinction coefficient算出来的浓度不准的
情况，这种情况大部分是因为蛋白的folding不同，有的蛋白里Trp等吸收基团都是暴露
在外面，有的蛋白中这些基团却是被包裹在蛋白内部的，所以含有同样成分的蛋白质，
有可能对紫外的吸收情况不一样。在拿到一个新蛋白时，为了确定它的extinction
coefficient，可以把这个蛋白用Guanidine HCl彻底变性，比较它变性前后的UV
absorption有没有变化，就知道计算出来的extinction coefficient是不是准确，如果
不准确的话，也可以通过这个方法算出表观的extinction coefficient应该是多少。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 学习了
: 另外用不用UV来粗测蛋白浓度只能说是每个实验室的习惯不同
: 不过我以后会用这个方法检测核酸污染
: 另外用紫外光吸收测浓度还是能差不少的
: 我今天刚遇到个例子
: 紫外测好了以后用Extinction coefficient算出来的
: 跟用BCA测出来的相差了一倍
: 所以我个人习惯还是不喜欢依赖紫外光吸收测浓度
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e****s
发帖数: 1125 | 48 从来没做过，不敢乱回答。
觉得His应该没问题，GST-tag估计得要Refold? 毕竟是酶和底物。
【在 n***w 的大作中提到】
: 谢谢了。。。
: 再问个问题，我如果变性提蛋白，是不是refold以后才能再bind to beads？
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n***w
发帖数: 2405 | 49 嗯。我也觉得换his tag好一些，但是那样的话，his tag就要留在fusion protein里了。
【在 e****s 的大作中提到】
: 从来没做过，不敢乱回答。
: 觉得His应该没问题，GST-tag估计得要Refold? 毕竟是酶和底物。
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i******k
发帖数: 4625 | 50 你本科不是学生物的or不是学化学的？
【在 x*****o 的大作中提到】
: 一直对于从包涵体里面提纯蛋白感兴趣. 是不是这样做不好? 我们组里面提纯的蛋白就
: 算是可溶性的也用non native的方法纯化,就是6M Urea denature,然后ion exchange
: FPLC, 然后再dialysis. 所以最后都用包涵体了.
: 是不是用ion exchange 必须denature阿?
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C*******e
发帖数: 4348 | 51 学习了
用GuHCl把蛋白彻底变性以后直接测么？
GuHCl会不会影响UV吸收光谱？
另外我还有个蛋白不仅不和bradford反应
连计算出的extinction coefficient都是0
我都不知道该怎么折腾它
不过奇怪的是用Gel Code Blue可以染色
【在 T**********t 的大作中提到】
: UV测蛋白浓度比BCA并不会特别不准，本质上都是吸收光谱嘛。
: 相反，因为UV测浓度不需要pipetting，不需要加特殊reagent，比BCA assay什么更便
: 捷，而且珍贵样品还可以回收。一般如果蛋白有紫外吸收，都可以用UV测浓度。
: 但是实际操作上，确实会有用计算出来的extinction coefficient算出来的浓度不准的
: 情况，这种情况大部分是因为蛋白的folding不同，有的蛋白里Trp等吸收基团都是暴露
: 在外面，有的蛋白中这些基团却是被包裹在蛋白内部的，所以含有同样成分的蛋白质，
: 有可能对紫外的吸收情况不一样。在拿到一个新蛋白时，为了确定它的extinction
: coefficient，可以把这个蛋白用Guanidine HCl彻底变性，比较它变性前后的UV
: absorption有没有变化，就知道计算出来的extinction coefficient是不是准确，如果
: 不准确的话，也可以通过这个方法算出表观的extinction coefficient应该是多少。
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C*******e
发帖数: 4348 | 52 有cleaveble的his-tag vector的
用rTEV切
了。
【在 n***w 的大作中提到】
: 嗯。我也觉得换his tag好一些，但是那样的话，his tag就要留在fusion protein里了。
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n***w
发帖数: 2405 | 53 嗯。我也是这么想的。
不用换载体，用pcr再加个6xhis tag-TEV cleavage sites到fusion pr.上去。
谢谢。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 有cleaveble的his-tag vector的
: 用rTEV切
:
: 了。
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c***y
发帖数: 615 | 54 能详细解释一下为什么在确定extinction coefficient 的准确性时，要比较变性前后
uv absorption的变化？多谢。
【在 T**********t 的大作中提到】
: UV测蛋白浓度比BCA并不会特别不准，本质上都是吸收光谱嘛。
: 相反，因为UV测浓度不需要pipetting，不需要加特殊reagent，比BCA assay什么更便
: 捷，而且珍贵样品还可以回收。一般如果蛋白有紫外吸收，都可以用UV测浓度。
: 但是实际操作上，确实会有用计算出来的extinction coefficient算出来的浓度不准的
: 情况，这种情况大部分是因为蛋白的folding不同，有的蛋白里Trp等吸收基团都是暴露
: 在外面，有的蛋白中这些基团却是被包裹在蛋白内部的，所以含有同样成分的蛋白质，
: 有可能对紫外的吸收情况不一样。在拿到一个新蛋白时，为了确定它的extinction
: coefficient，可以把这个蛋白用Guanidine HCl彻底变性，比较它变性前后的UV
: absorption有没有变化，就知道计算出来的extinction coefficient是不是准确，如果
: 不准确的话，也可以通过这个方法算出表观的extinction coefficient应该是多少。
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C*******e
发帖数: 4348 | 55 我说的不一定对，
不过就我的理解是extinction coefficient的计算是基于蛋白完全伸展的前提下的
就是没有任何折叠
相当于是变性后的蛋白
那么肯定跟折叠后的实际extinction coefficient有差别
【在 c***y 的大作中提到】
: 能详细解释一下为什么在确定extinction coefficient 的准确性时，要比较变性前后
: uv absorption的变化？多谢。
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s*******e
发帖数: 1389 | 56 同意，特别tag还是帮助溶解的，不带tag就不沉淀了？
我倒不怀疑结果，就像知道为什么。
【在 g*****p 的大作中提到】
: 你这个结果没办法自圆其说
: 你用阳离子再用亲和
: 和先用亲和有啥区别
: 原来纯化出来的容易沉淀，现在的就不沉淀了？
: 我想你还是得把原因搞明白才行
: 除非你的蛋白本身要么是什么核酸结合造成溶解性降低
: 要么结合了其他乱七八糟的东西导致这个结果
: 你用离子交换的的时候不小心把这些组分去掉了
: 不过这个可能性很低了
: 你这个实验结果太可疑了
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C*******e
发帖数: 4348 | 57 我也想知道为什么
我没说不带tag就不沉淀了
是亲和层析->低浓度，易沉淀（0.1-0.2mg/ml）
阳离子交换->亲和层析->高浓度，不沉淀（36 mg/ml）
对于这个我撒谎也没什么意义
总之对我来说是个好的结果就是了
现在我倾向于的解释是阳离子交换去掉了亲和层析不能去除的一些杂质
很可能是DNA，也有可能还有些别的杂蛋白
结果我的蛋白就behave了
【在 s*******e 的大作中提到】
: 同意，特别tag还是帮助溶解的，不带tag就不沉淀了？
: 我倒不怀疑结果，就像知道为什么。
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h*******0
发帖数: 48 | 58 是高峰度蛋白吗？如果产量低的话，不加tag容易纯化吗？
【在 W*****o 的大作中提到】
: 没说清楚，我说的是针对我们领域的蛋白。已经有很好的不用加tag可以完全纯化到和
: 自然蛋白结构、功能一样的蛋白。但很多组偷懒怕麻烦去用传统的tag,从包涵体沉淀、
: 复性的办法。这样得出的结果我们肯定没法相信。
: 当然对于一些还没有成熟办法纯化的蛋白用tag什么的无可厚非。
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s********n
发帖数: 2939 | 59 在这两个条件下，最终保存蛋白所用buffer的pH值有没有不同？
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我也想知道为什么
: 我没说不带tag就不沉淀了
: 是亲和层析->低浓度，易沉淀（0.1-0.2mg/ml）
: 阳离子交换->亲和层析->高浓度，不沉淀（36 mg/ml）
: 对于这个我撒谎也没什么意义
: 总之对我来说是个好的结果就是了
: 现在我倾向于的解释是阳离子交换去掉了亲和层析不能去除的一些杂质
: 很可能是DNA，也有可能还有些别的杂蛋白
: 结果我的蛋白就behave了
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T**********t
发帖数: 1604 | 60 对如何准确测量蛋白质摩尔消光系数感兴趣的同学，可以参看下面两篇文献：
Protein Sci. 1995 Nov;4(11):2411-23.
How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.
Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8563639
Anal Biochem. 1989 Nov 1;182(2):319-26.
Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.
Gill SC, von Hippel PH.
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0003269789906027
大部分蛋白质的实际摩尔消光系数和计算出来的摩尔消光系数相去不远，只有少数情况
需要做比较大的调整。但是对于一个新蛋白，用6M Gdn.HCl变性的方法测一下还是放心
一点，尤其是对于浓度测量精准度要求比较高的情况下。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 61 pH值没有不同
buffer也没有不同，Tris-HCl或者HEPES都可
【在 s********n 的大作中提到】
: 在这两个条件下，最终保存蛋白所用buffer的pH值有没有不同？
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C*******e
发帖数: 4348 | 62 我用的protein calculater
http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html
就是用的Gill & von Hippel的方法：
“Extinction coefficient estimated by the method of Gill and von Hippel
(Analytical Biochemistry, 182: 319-326, 1989)”
我觉得我是遇到了一个比较极端的特例
（差两倍）
data.
【在 T**********t 的大作中提到】
: 对如何准确测量蛋白质摩尔消光系数感兴趣的同学，可以参看下面两篇文献：
: Protein Sci. 1995 Nov;4(11):2411-23.
: How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.
: Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T.
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8563639
: Anal Biochem. 1989 Nov 1;182(2):319-26.
: Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.
: Gill SC, von Hippel PH.
: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0003269789906027
: 大部分蛋白质的实际摩尔消光系数和计算出来的摩尔消光系数相去不远，只有少数情况
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