n**8 发帖数: 221 | 1 想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA,可是怎么pcr都不work.
但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段 (~1kb)都能被P出来。现在怀疑是不
是反转没有得
到全长的cDNA。
请教大侠,一般这种情况该怎么对付?
不甚感激! |
C*******e 发帖数: 4348 | 2 1.可能没有全长cDNA
2.可能有全长cDNA,但是用的DNA polymerase没办法从你的模板里p 9kb
解决方法可以有
1.如果对cDNA质量有怀疑,重新制备
2.换DNA polymerase,我用过TAKARA的LA DNA polymerase,不过模板不是cDNA,是细
菌gDNA,
扩了13kb。模板是细菌gDNA还是人/老鼠 gDNA还是cDNA还有区别的,可以参考他们网站
3.既然小段的可以P出来,就重新设计引物,分两段或者分三段甚至四段扩,(互相
overlap)分别扩
好了以后再做mega PCR
【在 n**8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA,可是怎么pcr都不work. : 但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段 (~1kb)都能被P出来。现在怀疑是不 : 是反转没有得 : 到全长的cDNA。 : 请教大侠,一般这种情况该怎么对付? : 不甚感激!
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c******r 发帖数: 3778 | 3 9kb不算太过分,上面葡萄mm做了13kb,但是9kb确实也比较长,rt可能需要调整一下
protocol。实在不行只能分段pcr,然后接起来
【在 n**8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA,可是怎么pcr都不work. : 但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段 (~1kb)都能被P出来。现在怀疑是不 : 是反转没有得 : 到全长的cDNA。 : 请教大侠,一般这种情况该怎么对付? : 不甚感激!
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s******y 发帖数: 28562 | 4 这个不太可能是反转录的问题,更可能的是你克隆PCR的问题,
因为9k有点长的,一般的酶没有那么processive
【在 n**8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA,可是怎么pcr都不work. : 但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段 (~1kb)都能被P出来。现在怀疑是不 : 是反转没有得 : 到全长的cDNA。 : 请教大侠,一般这种情况该怎么对付? : 不甚感激!
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n**8 发帖数: 221 | 5 多谢大家的回复
PCR条件还好,因为同样的引物从genomic DNA 中能P出更长的(11kb),这是我的
positive control。
我是怀疑我的RT有问题。 |
n**8 发帖数: 221 | 6 我是想1.) 证明这个长片段cDNA的存在, 现在这个9kb是annotated (估计要做northern)
2.)克隆这个长片段并测序 |
s******y 发帖数: 28562 | 7 如果RT-PCR (oligo-dT做的话) 出了问题的话,那么你用靠近3'-end 和靠近
5'-end 的primer pairs 来作出的PCR 的条带粗细会有比较大的差别。
当然,也可以直接用northen 来证明。
【在 n**8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 多谢大家的回复 : PCR条件还好,因为同样的引物从genomic DNA 中能P出更长的(11kb),这是我的 : positive control。 : 我是怀疑我的RT有问题。
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C*******e 发帖数: 4348 | 8 如果说你需要的只是把这段cDNA扩出来
好作为实验材料进行下面的步骤
就不要去走弯路,证明长片段存在什么的
很多时候生物实验做啊做啊会容易舍本逐末
不过我不了解你的实验哈
就是这么一说
northern)
【在 n**8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我是想1.) 证明这个长片段cDNA的存在, 现在这个9kb是annotated (估计要做northern) : 2.)克隆这个长片段并测序
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C*******e 发帖数: 4348 | 9 hoho,承蒙院长还记得偶~
【在 c******r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 9kb不算太过分,上面葡萄mm做了13kb,但是9kb确实也比较长,rt可能需要调整一下 : protocol。实在不行只能分段pcr,然后接起来
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n***w 发帖数: 2405 | 10 原来你是mm。。。
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : hoho,承蒙院长还记得偶~
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n**8 发帖数: 221 | 11 谢谢大家的建议,因为还没有这个长片段的cDNA的证据,所以想先证实是存在的。。。
(香槟葡萄的ID好像很眼熟。。。) |
C*******e 发帖数: 4348 | 12 这个还“原来”
我真是要吐血
【在 n***w 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 原来你是mm。。。
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c******r 发帖数: 3778 | 13 是,这完全看lz想干嘛。
如果想clone这个cDNA来表达:那么就是一段一段clone了拼起来好了。
如果想看这个mRNA的表达量:可以northern,或者qPCR,不用管全长啥的。
如果想证明是否全长表达:可以做两个probe,一个在5',一个在3',做northern
完全没有必要一次RT全长RNA。
嘻嘻,没想到咱们同行,hand hand,以后mm多多指教
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果说你需要的只是把这段cDNA扩出来 : 好作为实验材料进行下面的步骤 : 就不要去走弯路,证明长片段存在什么的 : 很多时候生物实验做啊做啊会容易舍本逐末 : 不过我不了解你的实验哈 : 就是这么一说 : : northern)
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n**8 发帖数: 221 | |
c******r 发帖数: 3778 | 15 what???
反了吧?测序可以跟DNA上直接测,不用RT那么麻烦。如果一定要测RNA,那可以一段一
段测啊,反正也不能一次读9kb。设计几对sequence sepecific的primers去RT-PCR好了
。设计primer的时候可以在头尾加上内切酶位点,PCR product一半去测序,一半切一
下去克隆。
【在 n**8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我想要先测序再克隆。
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C*******e 发帖数: 4348 | 16 hand一下
我不去宝宝版了
所以比较少见到你啦
【在 c******r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 是,这完全看lz想干嘛。 : 如果想clone这个cDNA来表达:那么就是一段一段clone了拼起来好了。 : 如果想看这个mRNA的表达量:可以northern,或者qPCR,不用管全长啥的。 : 如果想证明是否全长表达:可以做两个probe,一个在5',一个在3',做northern : 完全没有必要一次RT全长RNA。 : 嘻嘻,没想到咱们同行,hand hand,以后mm多多指教
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n**8 发帖数: 221 | 17 sorry. 讲得有点confusing了。
其实是想请教大家对于反转长片段cDNA的一些技术窍门儿。。。 |
i***l 发帖数: 1656 | 18 你还真是较真儿
问你,光克隆个长的,能发文章不?
买房子讲究Location,搞生物讲究Phenotype,
有了表性才能发文章搞Grant,细枝末节较真儿没有多大意思
你克隆做的再好,有如何?
现在估计花钱都能让公司做克隆了
【在 n**8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : sorry. 讲得有点confusing了。 : 其实是想请教大家对于反转长片段cDNA的一些技术窍门儿。。。
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n**8 发帖数: 221 | 19 发不发文章跟克隆长短没有关系,现在早就不是克隆基因的年代了。
可是这个真的跟我做的biological story有关系啊。
呵呵,不较真了。 |
I*********r 发帖数: 8 | 20 在反转录时,不适用random primer,直接使用你的primer,是否可行?
【在 n**8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA,可是怎么pcr都不work. : 但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段 (~1kb)都能被P出来。现在怀疑是不 : 是反转没有得 : 到全长的cDNA。 : 请教大侠,一般这种情况该怎么对付? : 不甚感激!
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c******r 发帖数: 3778 | 21 你说说你的story?很多实验技术上有时候会有这样那样的难题。虽然不是不可解决,
但是如果答案比手段更重要的时候,太纠结于一个手段没有必要。想个办法绕过去好了
。关键是这样节省很多时间,咱们自己的青春不是。
如果你一定要RT一段很长的RNA,9kb并非不可能,但是效率比较低,也不是非常
reliable。更重要的是里面可能会有错误。如果你觉得这都不重要,就是把它RT出来最
重要,建议你找找有没有想关的protocols,应该有很多很多。
比如invitrogen的这个kit,就可以rt up to 9kb:
https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.
unitSectionTree&treeNodeId=3DE1D285EC91ED2AA3E282E1D0D52A68
还有qiagen的这个kit,up to12.5kb:
http://www.qiagen.com/products/pcr/longrange/qiagenlongrangepcr
【在 n**8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 发不发文章跟克隆长短没有关系,现在早就不是克隆基因的年代了。 : 可是这个真的跟我做的biological story有关系啊。 : 呵呵,不较真了。
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Z******5 发帖数: 435 | 22 制备cDNA方面可以做的改进:
1,最好直接用gene specfic primer做反转录,延长反转录反应的时间;
2,如果不用1,最好用oligo dT;
3,如果非要用随机引物,最好减少引物用量(参考invitrogen SuperScript Ⅲ说明书) |
n**8 发帖数: 221 | 23 多谢回复!
to院长,
想弄下来测序,看看怎么splicing的,还有看看predicted的motif还在不在,你之前说
的那个分段测序,我已经做过了,可是这并不能说明这个全长的cDNA存在啊?准备做
northern,但是也只能看size,具体的molecular lesion 还是不确定。
你说的这么长PCR出来不reliable,只是先粗测序看看,真正要最终高保真的克隆,当
然会分段做。
to Zifeng9527,
想搞全长的cDNA,自然尽量不会去用random primer 反转。 |