问几个关于转染的问题，请大家指教 - Biology版 - 未名存档

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Biology版 - 问几个关于转染的问题，请大家指教

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b**********8 发帖数: 349	1 如题，最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因 A后，对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表达）。我尝试过两种不同的转染顺序，如下： 1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释， 2）考虑到可能是先转染siRNA会影响后续质粒的转染效率。于是换方案，先在6孔板中铺板，第二天转染质粒，过夜后换液，转染24小时候胰酶消化，将细胞铺到24孔板中， 24小时后再分别转染siControl和siA，出来的结果漂亮多了，至少data不像前一种方案那么难看了。我想问一下，第二种方法是否合理，虽然两种方法我都在文献上看到过，但是私以为第 1中方案似乎更为合理，但是在我们的实验中，它对renilla的影响实在太大。另外，想问一个lipofectamine2000的转染问题，以6孔板为例，mannual上建议的 volume of plating medium是2ml，volume of diluting medium 为250*2=500ul，那么最后转染的培养基总体积到底应该是2ml，还是2.5ml，我一直是用2ml，可是经常发现毒性太大，即使在质粒和lipo减半的情况下。今天师姐告诉我她一直用的是2.5ml，各位，你们是怎么弄的，最近试验不顺利，弄得自己都怀疑自己的每一步是不是都有问题了。谢谢
A******d 发帖数: 571	2 lipofectamine2000的转染，我用2毫升，没有问题。可能和细胞还有plasmid有关系，你光lipofectamine2000的no DNA control也有毒性？
b**********8 发帖数: 349	3 谢谢楼上的回复有人回答我的第一个问题么？多谢各位

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