P******r
发帖数: 966 | 1 6孔板用前后左右震荡还行，24孔板的全在中间一坨了。 |
|
C****b
发帖数: 90 | 2 加样之前混合均匀，加入每个孔后，不要马上把板放回培养箱，而是放在静止的桌子上
等45～60分钟后再放入培养箱， 这样细胞会很均匀。
原理很简单。培养箱里有个小马达，为保持恒温，不断工作。这样， 处于悬浮状态的
细胞也会随着不断震动，导致挤在中间。桌面静止一段时间， 细胞靠重力自然沉降，
非常均匀。
不要担心。90分钟细胞没有CO2， 没有关系。
这个方法同样适用于384，96和别的孔板。尤其是对用scope来分析结果的大有好处。
我一直沿用这个方法已经有5年了。
祝好运！ |
|
s********r
发帖数: 312 | 3 以96孔板为例，吸掉培养基，加200-250ul冻存medium，然后用排枪在孔里搅合搅合，
把克隆刮下来就行了。 |
|
|
b******s
发帖数: 5365 | 5 用microplate shaker很好用，96孔板10秒钟的震荡都能把细胞分得很均匀。 |
|
s********r
发帖数: 312 | 6 我可能没说清楚。96孔板里是挑的细胞 single colony。我想从里面筛到到genomic
DNA上带那个突变的细胞系。 |
|
s********r
发帖数: 312 | 7 买瓶epicentre的DNA QuickExtract 就可以了，拿到的是比较dirty的DNA prep,但是做
PCR没问题，关键是方便便宜。原来我用Qiagen, Zymo的96孔板kit，又贵又麻烦。 |
|
q**********0
发帖数: 335 | 8 请大家推荐一个用于96孔板的加样并作系列稀释的仪器，主要由于快速的药物筛选试验
。谢谢！ |
|
v********a
发帖数: 646 | 9 请问大家都是怎样从96孔～12孔板上收获细胞，用来裂解做WB?
不考虑靶蛋白的丰度，一般24孔板用多少微升裂解液裂解，并从中取多少跑SDS-PAGE?
Thanks. |
|
h******t
发帖数: 10 | 10 我做过，96 孔板每个孔的primer 和 template 都不一样，不能上排枪，加的想撞墙。
我一般都是先一次加template，加完了再加 primer，然后别的。 比如加template 的
时候都加在每个孔的左下方，加完了看一下，然后primer 加在右下方。如果东西太多
，加过一轮就把液体弄到板子的底部去。 |
|
j******n
发帖数: 941 | 11 加到孔里后用一毫升的枪到处多吹几下 另外建议培养体积大一些 防止表面张力的影响
要避免计数后先加入一定量体积再补足培养液 最好在孔外混好后一次性加入 |
|
d*******j
发帖数: 64 | 12 有robot的话，一个人一个下午可以加48个384板。不过你要是一年就加这么6个96孔板
的话，可能还是用multiple channel pipette快些。 |
|
a*********n
发帖数: 2526 | 13 在加样之前搅匀,然后一个孔加2ml cells, 轻轻放回培养,over |
|
i*********0
发帖数: 915 | 14 他们都是在48孔做，基本上是dispase去消化一下，然后吹打。
最好不要做单细胞悬液。
可哟考虑用rock inhibitor，但是听说会增加mutation的几率。 |
|
s********r
发帖数: 312 | 15 如果用surveyor assay的话会不会很贵？PCR产物直接做，还是要用96-well
purification kit再过一遍？ 不同孔的DNA浓度怎么normalize？
另外好像以前听说过可以用Taqman做realtime PCR based point mutation detection,
这个有成熟的方法么？
谢谢！ |
|
s********r
发帖数: 312 | 16 96孔板总比那个realtime384好多了吧。。做realtime每次眼睛都要瞅瞎。 |
|
c****n
发帖数: 1108 | 17 【 以下文字转载自 Postdoc 讨论区 】
发信人: XIXIHAHAGG (XIXI), 信区: Postdoc
标 题: 薄后刚开工做个最简单的实验被笑话了，大家帮看看
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Mar 8 00:03:03 2011, 美东)
刚毕业开始做薄后，老板底下加我一起5个薄厚，没有学生。其余4个在老板底下做了6
年以上了，呵呵
我以前做肿瘤的，现在的老板做神经领域。老板希望我做某一个环境毒物（他们实验室
以前没做过）对神经细胞的影响等等。查了一下文献，做这个的不多，用这个chemical
处理过神经细胞的文章只有一篇。他们文章中有viability data等。我准备自己先做做
viability 看看浓度，处理时间等。准备开工，结果被其余博后嘲笑了一番。不知道我
是不是真的科研思维太弱了，很郁闷：
1, 他们说别人都做过viablity了，你为什么还要做？直接用他们的结果选浓度不就行
了么？难道你不看别人的文献么？觉得比较郁闷，文献我看了，我总得自己看看结果吧
，不对么
2，我准备用96孔板做viability，细胞还没好，今天只是准备，我在那里... 阅读全帖 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 18 对于第一个，你的做法是正确的。不同实验室的不同细胞株对药物敏感型不一样。
对于第二个，各有各的道理。２４孔板每个孔细胞多，偏差是会小一些，对于
后续的生化试验因为样品量大一些也会准一些。但是９６板可以一个板上作
好几个重复，所以平均下来后并不比２４孔的差多少。尤其是对于做ELISA
而言，其实96孔板反而更好（因为探头很小，多出来的地方反正探不到）
不过，９６孔板的孔小，溶液表面张力明显，对于那些对环境敏感的细胞不好。
不知道你们的神经细胞是否属于这样的范围？ 对于那些特别大或者特别长的
细胞（比分说某些神经元细胞），的确是大孔板好一些。
6
chemical |
|
X********G
发帖数: 326 | 19 刚毕业开始做薄后，老板底下加我一起5个薄厚，没有学生。其余4个在老板底下做了6
年以上了，呵呵
我以前做肿瘤的，现在的老板做神经领域。老板希望我做某一个环境毒物（他们实验室
以前没做过）对神经细胞的影响等等。查了一下文献，做这个的不多，用这个chemical
处理过神经细胞的文章只有一篇。他们文章中有viability data等。我准备自己先做做
viability 看看浓度，处理时间等。准备开工，结果被其余博后嘲笑了一番。不知道我
是不是真的科研思维太弱了，很郁闷：
1, 他们说别人都做过viablity了，你为什么还要做？直接用他们的结果选浓度不就行
了么？难道你不看别人的文献么？觉得比较郁闷，文献我看了，我总得自己看看结果吧
，不对么
2，我准备用96孔板做viability，细胞还没好，今天只是准备，我在那里找排枪。另一
个薄厚过来看见了说：你怎么用96孔板做？我们从来不用的，这个结果怎么能信呢，最
后收蛋白什么的都用dish，比96孔大多了，这样出来的viability 和最后处理细胞的肯
定差异很大。哎，只有肿瘤的现在还在用96孔板吧。虽然有点不高兴，我还是笑着问他
那你... 阅读全帖 |
|
o***s
发帖数: 42149 | 20 上周四沸沸阐才抵达洞洞上海的阿根廷登基雄镍外援孔卡也出痴痴惊媚媚冯媚现在
首批前往描描描土耳其巩巩辩斜的大部哥旭哥哥队中，耐标初来乍拷拷拷止到的他缺缺
缺缺缺蔷蔷酵倔鞠鞠一路上与巴西次晰晰树外援达越侣越维形影钵钵撑荐不离。
沤沤孔卡身镇捎裙镇裙板让队掀掺掺掀掺友惊讶
暑口暑大众眼中有些胡胡胡腼腆的捧渭捧渭孔卡，屋勤屋勤勤要浑静镀在队友中间
正载丝澈载寺编寺寺如孙祥汇肩汇肩描述的熊熊那样活泼、瓮炕瓮应炕开朗，裴裴裴裴
并且主义义动与每位新队竞烟痕媒忱媒媒忱友握手致意。并脱并别看他风遏个子看唉唉
恐起来小早劣早，身板儿绝对网鲤网鲤不差。“刚刚废废蜘握手的围围时候我燎惶惶酉
酉酉们还拥箱肪磕肪箱抱了一下，我榆嘲都摸到焦焦焦嗓绅嗓他身上那肌肉上上上等上
了，真司司憋是深藏键梯不露啊绷绷董。”队友彦击王佳玉报赞报赞说。
柄柄坎对于这盲眷草群年轻阐阐缄阐人来说，抵达吼瞒吼仕机场之品羔羔征征在在
征后几乎都有着久五五久久共同的州幻州钵州洞裂洞裂裂第一任桐桐桐监监务，那康碘
康康康就是为幼哀幼幼老婆和碴碴女友购佳佳置免税产品，园园忿薄忿薄忿化妆品、护
肤品厅厅等成了救城城救蕉叶蕉叶球员们的目标猪... 阅读全帖 |
|
B*D
发帖数: 5016 | 21 MSI的H55
板长24cm，而非标准的24.4CM
结果尾部两个孔和底板的螺栓配合不上
怎么会有这样的事情？差半个孔的距离，我还以为机箱底板的孔错了
结果拿Gigabyte的 785G一对，底板的孔完全是对的
结果一量，MSI的板长是24cm....最后的两个孔当然对不准了，
有的小mATX板的长度是20cm左右，比如Gigabyte的H55，这个倒也算了 |
|
s******s
发帖数: 2074 | 22 from:
http://www.flutefriends.com/about_headjoint.htm
长笛的吹口是个神秘的部位，很多朋友想了解这方面的知识，结合自己的实践会对演奏
水平的提高起到不可低估的帮助。这里摘录一篇HK先生的文章供大家参考：
HK先生略談笛头:
- 吹孔越圆,音色越甜,越圆滑,但泛音組也就减少;
- 吹孔越方或平直,音色越不甜,但泛音組就很大,声音更穿透;
- 音腔越大,或烟囪高(等于音腔空間大了), 就越响亮, 共振力越好;
- 音腔越小,或烟囪低(等于音腔空間小了), 就越不响, 共振力差,金属味也多了;
- 內切割大小也影响了音腔;
- 吹孔越大, 越像金属声;
- 吹孔越小, 越像木笛声(你现在很难找到吹孔小的金属长笛了,除了百年古董,相反可
以买仿巴洛克木笛头或国产的木笛头!外国产的木笛头已經改得和現代金属笛头一樣,沒
意思,沒分別了. 中国人自古以來造木是比造金属強! );
- 去风板越窄, 越金属, 但反应就越快,越灵敏;
- 去风板越圆, 越木声, 但反应就越慢,不灵敏;
- 材料的影响不太大, 不能說沒有, 是有的, 吹的人可以分得出來, |
|
f********s
发帖数: 115 | 23 你说的很多我都同意。只不过现在我想定量的的来分析一种特定的 progenitor （ex.
CMP） 分化到各个lineage 的能力。我觉得在把多个progenitor 接种到同一个盘子上
有几点非常影响我做定量分析：
1.你在挑集落的时候是可以看到集落的样子的，所以也许你会不自觉的多挑或者少挑某
些集落，引入bias;
2.在挑集落的时候，大的集落容易挑出来，小的集落不容易挑，即使挑了小集落在后续
实验过程中不知道怎么就不见了 (而且大小通常意味着不同的lineage)，也会严重影响
实验者的判断。
因此，我觉得一定要接种单细胞到96孔板里，在不看孔的情况下, 随机挑选比如说20个
孔来观察，这样可以得到各种百分比，比如说百分之多少的单细胞能形成集落，百分之
多少的细胞能形成红细胞集落，多少能形成粒细胞集落……不知道关于这一点你是否同
意？
在这个基础上，我想知道半固体和全液体培养基在这个实验里的优劣。我能想到的半固
体的坏处在于，1.如果你不看孔，不知道这个克隆在哪里，你就要把全部的200ul半固
体培养基吸出来，非常不利于cytospin. 2.而且半固体培养基会有一部分粘在t... 阅读全帖 |
|
i***s
发帖数: 39120 | 24 一篇名为《5个闷死在垃圾桶里的毕节男孩，让她淡出了大银幕》的文章，让孔维在各个社交平台上刷屏了。
孔维（资料图）
这几日，一篇名为《5个闷死在垃圾桶里的毕节男孩，让她淡出了大银幕》的文章，让孔维在各个社交平台上刷屏了。这篇文章的内容，来自她在7月29日播出的《我是演说家》的讲稿。这个曾在《太阳照常升起》中惊艳亮相的女星，从2012年起开始逐渐淡出大银幕，近4年之久，这是她首次通过一档综艺节目回归荧屏。然而，这次回归，她的身份并不是一个演员，而是一个叫做传梦公益基金的项目发起人。在这次演讲中，她娓娓道来自己在近4年来，是如何从单纯想要捐个款，变成为何发起了这个以关怀留守儿童心灵为主的公益项目，并且全身心投身其中，发起了十二个项目学校，培养了48个当地的老师，直接受助孩子达3000多人，与此同时，也以无法分身当演员，失去了很多宝贵的演出机会。这个故事，不仅感动了在场无数观众，在文章被传播出来，也感动了无数社交平台的用户。
那么，究竟她为什么会在那样一个时刻做出关键的转变呢？又为何要选择在近四年后通过《我是演说家》复出？腾讯娱乐联系上了孔维本人。接通电话的那一刻，她刚刚面试完一些志愿者，嗓音... 阅读全帖 |
|
b*****e
发帖数: 14299 | 25 ☆─────────────────────────────────────☆
Cajal (天下第二乌鸦嘴) 于 (Thu Apr 12 22:47:03 2007) 提到:
看见医院上带sinar板的schneider镜头不少。
☆─────────────────────────────────────☆
tyning (俗人*把糖水进行到底) 于 (Thu Apr 12 22:49:31 2007) 提到:
不行。
Graflex的板你可以去midwestphoto买，有copal 0, copal 1两种尺寸的。
ebay上有个卖家卖custom make的板，挺便宜的。不过看照片做工很一般，你可以要求
任意的孔尺寸。
☆─────────────────────────────────────☆
Cajal (天下第二乌鸦嘴) 于 (Thu Apr 12 22:51:48 2007) 提到:
如果不行，那问题是另找一个graflex的板镜头还装得进去么（我指标准的graflex板）
，如果镜头的中间口径其实比标准板孔大的话。
☆─────── |
|
v**e
发帖数: 8422 | 26 凤凰网调查证明大部网友支持孔庆东骂某刊记者，图证
14186 次点击
210 个回复
0 次转到微评
乐呵呵22 于 2011/11/10 20:51:17 发布在 凯迪社区 > 猫眼看人
凤凰网调查证明大部网友支持孔庆东骂某刊记者，图证
http://club.kdnet.net/dispbbs.asp?boardid=1&id=7905227&page=1&1
从前天开始，全国的各大媒体开始了集中火力对孔庆东骂记者的猛烈轰炸。凤凰网
同时跟进，做了一个调查网页，昨天看投票结果是多数网友支持孔庆东。昨天凤凰网制
作了一专题页面，继续炮轰孔庆东。今天更多的评论文章跟进，而且后续报道说，北大
宣传部开始调查孔庆东，同时报道孔庆东公开声言，骂南方系记者是八路军骂鬼子，态
度更加坚硬。前媒体人阿忆也出来一面调节一面幸灾乐祸，百家讲坛坛主纪连海出来鸣
不平，吸引火力。真是一片热闹。
热闹中可以看出的事实如下：
一、这是一次有策划的媒体事件。全国媒体一起联动，说明出于复杂的原因，媒体
打算灭掉孔庆东。我分析这很大程度上会成功，过去这样类似的事件不少了。
二、媒体人有利益... 阅读全帖 |
|
c***c
发帖数: 21374 | 27 ☆─────────────────────────────────────☆
phial (ppp) 于 (Fri Nov 18 00:15:25 2011, 美东) 提到:
中国民间舆论和媒体舆论彻底分裂了
南方系从来没在网上被这样骂过吧
http://www.weibo.com/nfbyw
翻了快10页了 全是去骂南方系的
☆─────────────────────────────────────☆
smokinggun (硝烟) 于 (Fri Nov 18 00:33:28 2011, 美东) 提到:
南方系背后是福特系，现在更应该对福特系穷追猛打！
☆─────────────────────────────────────☆
doginafei (自带豆包的六毛) 于 (Fri Nov 18 00:43:44 2011, 美东) 提到:
☆─────────────────────────────────────☆
rainyrry (Flora) 于 (Fri Nov 18 00:46:42 2011, 美东) 提到:
其... 阅读全帖 |
|
t******n
发帖数: 2939 | 28 ☆─────────────────────────────────────☆
bigapple331 (大苹果) 于 (Sat Jan 28 01:14:04 2012, 美东) 提到:
最近网上最热门的话题除了龙年春晚，恐怕就是著名的香港地铁骂战了。早几天看了这
条新闻，没太当回事儿，这种事儿在国内随时随地都在发生，没什么新鲜的。可后来大
嘴孔和尚在节目中骂香港人是狗，激起了这场越来越多人参与的骂战。前两天MITBBS上
满篇都是张绍刚和刘俐俐，这两天就基本上都在讨论这场骂战了，每个帖子都是火药味
浓烈，从满清到民国到共和国一股脑的旧账都翻出来了。实在忍不住，就把那段骂战的
视频和孔和尚的节目都看了一遍。我曾于2003年去香港科技大学学习过半年的时间（想
起来也有十年了，时间真是一把杀猪刀），多少对香港有一些了解，所以想说说自己对
这件事儿的看法。
当时一起去香港科技大学学习的有全国好几所高校选派出来的交换生，由于刚开
始我们听不懂香港话（其实后来我也没听懂过），我们这些大陆的学生在一起玩的比较
多，随着大家选不同的课程，也渐渐的有了一些香港的同学和朋友。一个... 阅读全帖 |
|
o***s
发帖数: 42149 | 29 孔庆东贴莫言8岁旧照
“迷失真我”的难道是莫言
这是莫言20岁之前惟一的一次照相，时间大约在1962年春天。照片上的莫言上穿棉袄，下穿单裤。
据他自己所说，棉袄上的扣子还缺了两个；胸前闪闪发光的，是积累了一冬天的鼻涕和污垢；裤腿一长一短，不是裤子的问题，是不能熟练地扎腰所致。
在他旁边一起合影的，是他的堂姐。
北大教授、“大嘴”孔庆东又耐不住寂寞了，他这次吐槽的对象，是中国唯一的诺贝尔文学奖得主、作家莫言。4月8日上午，孔庆东在微博上贴出一张黑白照片，并配文称“文学虚构可以改变真实记忆，甚至作家也会迷失真我。”
尽管孔庆东并未点名，但网友很快发现，照片上的小男孩是莫言。一时间，关于莫言的作品、人品，甚至那段历史，都成为了网友口水战的内容。
孔庆东发声：贴图加转发表达意图
莫言或许没有想到，自己唯一一张儿时旧照，竟会被人翻出来说事儿。翻照片的人，还是“大嘴”孔庆东。
照片上的莫言，尽管看起来只有七八岁，但脸型和现在基本一样是方脸。引起争议的，正是这张方脸，以及身上穿着的棉袄。
孔庆东在微博中还说，“某作家常写自己小时候饥寒交迫，这是他1962年春天的照片。”12分钟之后，孔庆东又转发了网... 阅读全帖 |
|
b**********8
发帖数: 349 | 30 如题，最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因
A后，对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表
达）。我尝试过两种不同的转染顺序，如下：
1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第
四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左
右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释，
2）考虑到可能是先转染siRNA会影响后续质粒的转染效率。于是换方案，先在6孔板中
铺板，第二天转染质粒，过夜后换液，转染24小时候胰酶消化，将细胞铺到24孔板中，
24小时后再分别转染siControl和siA，出来的结果漂亮多了，至少data不像前一种方案
那么难看了。
我想问一下，第二种方法是否合理，虽然两种方法我都在文献上看到过，但是私以为第
1中方案似乎更为合理，但是在我们的实验中，它对renilla的影响实在太大。
另外，想问一个lipofectamine2000的转染问题，以6孔板... 阅读全帖 |
|
b**********8
发帖数: 349 | 31 新手，最近在做一个质粒的稳定转染至肝癌细胞，大概步骤如下，6孔板中转染，24小
时后按1:50的比例传至10cm dish中，（大约1~2万个细胞），再等24小时开始加药筛选
，没隔3天换液维持，至第9天前后开始出现大量细胞死亡，并出现镜下明显可见的
colony，至第12天左右出现肉眼下明显可见的colony，于是用黄色tips直接在肉眼下挑
取单个colony，分别转移至96孔板中培养，并逐渐放大至24孔板，然后进行鉴定。至今
挑了大概40个colony，仅有一个阳性，但是继续放大培养两代后阳性反应突然丢失。
现在我有两个问题,
1）阳性反应突然丢失的原因可能是什么？细胞不纯？阳性细胞被其他细胞取代？筛选
出colony并放大培养的最初几代过程中，是否一定不能中断选择药物？哪怕只有两三天
的中断？
2）在网上翻了些帖子，发现有的人会在挑出单个colony培养贴壁后在做有限稀释，挑
取单克隆，这样做是不是会是拿到真阳性克隆的机会更大？可不可以按照这样的思路来
做，先用我上面的挑取，培养并鉴定出一批（视运气好坏多少不等）有阳性反应的
colony（姑且认定这个colony里面含有我想要... 阅读全帖 |
|
l**i
发帖数: 8144 | 32 孔庆东：民资进国家重要领域 或把社会主义制度摧毁
孔庆东：民资进国家重要领域 或把社会主义制度摧毁
2012-02-22 文字来源：第一视频
首发：http://www.szhgh.com/?action-viewnews-itemid-9554
文章摘要:日前，国家发展改革委召开由45个部门参加的会议，部署落实鼓励和引
导民间投资健康发展实施细则制定工作。
主持人：各位网友大家中午好，这里是第一视频新闻网为大家直播的《孔庆东有话
说》，我是石菲。
孔庆东：中午好各位网友，今天是阳历2月22日，今天阴历也进入到2月份，按照阴
历算，正月结束了。
主持人：我们来看一下今天的新闻。日前，国家发展改革委召开由45个部门参加的
会议，部署落实鼓励和引导民间投资健康发展实施细则制定工作。一起来看一下。
主持人：欢迎回来。好久没聊到有关发改委的新闻了。
孔庆东：前一段聊过国务院开会，要求民间金融资本进入很多重要的领域部门，我
们已经谈过这个话题，并且对这个问题表示担忧。刚才我们看播出的新闻，新闻内容写
的简洁扼要，播新 闻的 先生有气无力，我也这样，我觉得这个新闻对我没有什么好
处，... 阅读全帖 |
|
c***s
发帖数: 70028 | 33 曾经号召全国人民起诉南方报系的北京大学教授孔庆东接受《重庆日报》专访时宣称，中共重庆市委书记薄熙来在重庆市委三届九次全会上关于共同富裕的讲话，立场坚定、旗帜鲜明地说出了广大老百姓的担心与忧虑，说出了真正的共产党人坚持走社会主义道路，践行共产党的宗旨，实现共同富裕的理想与愿望。
北京大学中文系教授孔庆东（资料图片）
8月23日，《重庆日报》在最近推出的“认真学习贯彻胡锦涛总书记‘七一’重要讲话 中共重庆市委三届九次全会精神”专栏中刊登了专访孔庆东的内容。
十分关注重庆的情况，还多次赴重庆调研的孔庆东说，重庆是在走一条新时期的科学发展新路，这样的探索与创新，放在全国范围内都具有示范意义。看待重庆实践，还需要有更宽广的历史视野。如今中国经济发展了，GDP已经达到世界第二，但贫富差距、城乡差距却急剧扩大，两极分化日趋严重，老百姓能没意见吗？
“重庆吹响共富号角，不仅是个经济议题，更是文化议题、政治议题。”孔庆东说，“任何把政治、经济、文化简单分开来看的做法，都是不可取的。按照一般人的理解，打黑应该属于政治议题，唱红是文化议题，共同富裕可以算作经济议题。”
孔庆东解释说：“如果重庆不打黑，黑恶势... 阅读全帖 |
|
C********g
发帖数: 9656 | 34 【 以下文字转载自 Headline 讨论区 】
发信人: Cnews (chinanews), 信区: Headline
标 题: 孔庆东挺薄熙来:批"唱红"的人"别有用心"
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Aug 23 20:09:47 2011, 美东)
曾经号召全国人民起诉南方报系的北京大学教授孔庆东接受《重庆日报》专访时宣称，中共重庆市委书记薄熙来在重庆市委三届九次全会上关于共同富裕的讲话，立场坚定、旗帜鲜明地说出了广大老百姓的担心与忧虑，说出了真正的共产党人坚持走社会主义道路，践行共产党的宗旨，实现共同富裕的理想与愿望。
北京大学中文系教授孔庆东（资料图片）
8月23日，《重庆日报》在最近推出的“认真学习贯彻胡锦涛总书记‘七一’重要讲话 中共重庆市委三届九次全会精神”专栏中刊登了专访孔庆东的内容。
十分关注重庆的情况，还多次赴重庆调研的孔庆东说，重庆是在走一条新时期的科学发展新路，这样的探索与创新，放在全国范围内都具有示范意义。看待重庆实践，还需要有更宽广的历史视野。如今中国经济发展了，GDP已经达到世界第二，但贫富差距、城乡差距却急剧扩大，两极分化日趋严重，老百... 阅读全帖 |
|
c******r
发帖数: 3778 | 35 这玩意儿就是一个体力活儿。都是实验室常规。
做起来也简单。就是ls说的。你先不要挑clone。直接pool用药到足够cell，然后seed
到96孔板上。数好细胞数，大概是每个板放50个细胞，就是每个孔0.5个细胞的样子。
seed几个板，4-5个其实就够了。这样大概一共seed了200到250个细胞。还是要在药里
面长，也可以浓度减半。如果够狠，多seed几个板，正常浓度的药也能长起来的。然后
就是说confirm一下表达，挑表达量合适的留下几个clones就可以了 |
|
m****M
发帖数: 360 | 36 有谁知道什么试剂可以有效的把细胞裂解出的总蛋白固定到９６孔板（任何商业化的９
６孔板或其他任何孔的商业化的都可以）上吗？
试剂去除后固定作用也消失，这样后面加入的蛋白不会被固定。
即，只固定第一步的总蛋白。谢谢 |
|
发帖数: 1 | 37 小弟最近用SH-SY5Y做CRISPR。CRISPR本身是没问题的，但在single cell expansion的
步骤出了问题。
稀释法得到的单细胞在96孔板里生长大概一个星期，就长成一团细胞。但接着细胞就“
扩张”不下去了，只会在那一小团里越长越密，而不像其他细胞可以容易的长满整个96
孔板。
这时候我就用常规的Trypsin来消解，把这一团细胞打散。可问题是，这样处理后细胞
很快就死掉了。
我想请教：
1. SH-SY5Y从单细胞是否可以长满整个96-well的孔？这个细胞可以从single cell长成
一团，为何就无法继续扩张下去了呢
2. 我的问题主要出在哪里呢？我个人分析觉得最大可能是Trypsin过于harsh。而且我
在操作过程中可能Trypsin incubation的时间过长。那么有没有什么相对温和的
Trypsin可以替代呢？我网上查到比如Accutase，不知道大家还有什么别的推荐？
3. 除了SH-SY5Y, 还有什么其他human neuronal cell line推荐呢？感觉神经细胞总是
挺脆弱的。
非常感谢！ |
|
m****M
发帖数: 360 | 38 有谁知道什么试剂可以有效的把细胞裂解出的总蛋白固定到９６孔板（任何商业化的９
６孔板或其他任何孔的商业化的都可以）上吗？
试剂去除后固定作用也消失，这样后面加入的蛋白不会被固定。
即，只固定第一步的总蛋白。谢谢 |
|
m****M
发帖数: 360 | 39 有谁知道什么试剂可以有效的把细胞裂解出的总蛋白固定到９６孔板（任何商业化的９
６孔板或其他任何孔的商业化的都可以）上吗？
试剂去除后固定作用也消失，这样后面加入的蛋白不会被固定。
即，只固定第一步的总蛋白。谢谢 |
|
m****M
发帖数: 360 | 40 有谁知道什么试剂可以有效的把细胞裂解出的总蛋白固定到９６孔板（任何商业化的９
６孔板或其他任何孔的商业化的都可以）上吗？
试剂去除后固定作用也消失，这样后面加入的蛋白不会被固定。
即，只固定第一步的总蛋白。谢谢 |
|
m****M
发帖数: 360 | 41 有谁知道什么试剂可以有效的把细胞裂解出的总蛋白固定到９６孔板（任何商业化的９
６孔板或其他任何孔的商业化的都可以）上吗？
试剂去除后固定作用也消失，这样后面加入的蛋白不会被固定。
即，只固定第一步的总蛋白。谢谢 |
|
m****M
发帖数: 360 | 42 有谁知道什么试剂可以有效的把细胞裂解出的总蛋白固定到９６孔板（任何商业化的９
６孔板或其他任何孔的商业化的都可以）上吗？
试剂去除后固定作用也消失，这样后面加入的蛋白不会被固定。
即，只固定第一步的总蛋白。谢谢 |
|
m****M
发帖数: 360 | 43 有谁知道什么试剂可以有效的把细胞裂解出的总蛋白固定到９６孔板（任何商业化的９
６孔板或其他任何孔的商业化的都可以）上吗？
试剂去除后固定作用也消失，这样后面加入的蛋白不会被固定。
即，只固定第一步的总蛋白。谢谢 |
|
m****M
发帖数: 360 | 44 有谁知道什么试剂可以有效的把细胞裂解出的总蛋白固定到９６孔板（任何商业化的９
６孔板或其他任何孔的商业化的都可以）上吗？
试剂去除后固定作用也消失，这样后面加入的蛋白不会被固定。
即，只固定第一步的总蛋白。谢谢 |
|
m****M
发帖数: 360 | 45 有谁知道什么试剂可以有效的把细胞裂解出的总蛋白固定到９６孔板（任何商业化的９
６孔板或其他任何孔的商业化的都可以）上吗？
试剂去除后固定作用也消失，这样后面加入的蛋白不会被固定。
即，只固定第一步的总蛋白。谢谢 |
|
m****M
发帖数: 360 | 46 有谁知道什么试剂可以有效的把细胞裂解出的总蛋白固定到９６孔板（任何商业化的９
６孔板或其他任何孔的商业化的都可以）上吗？
试剂去除后固定作用也消失，这样后面加入的蛋白不会被固定。
即，只固定第一步的总蛋白。谢谢 |
|
h****a
发帖数: 65 | 47 我是新手，正准备做crispr point mutant, 很多问题想请教
1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
PCR鉴定的模板是96孔板里面的细胞提取的g... 阅读全帖 |
|
m*********D
发帖数: 1727 | 48 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
**我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
*... 阅读全帖 |
|
r********1
发帖数: 7345 | 49 “海特”吉尼斯是海军特种部队的一项极限挑战活动，也是一套引进并改良的训练方法
，在每个月最后一个周末定期开展。最初是李烨睿留学归国后，在连队与战士比赛谁用
最短的时间成功钻木取火演变来的，当时创下的32秒纪录至今没人打破。
新的“海特”俯卧撑纪录已于北青报记者采访前诞生，1432个。据北青报记者了解，这
项活动自开展以来，几乎每个月就有一项纪录被刷新，每一季度就有一个科目成为新的
挑战项目。
技能
炼狱式训练打造铁汉
特种兵总是能引起人们的关注，不仅是因为这是一个特殊的兵种，还因为传说中的特种
兵残酷得有如炼狱的训练方式和适应各种恶劣条件的单兵素质。
忍受瓦斯和虐俘考验
几年前，李烨睿赴某国特种作战学校军事留学，以第一名的优异成绩毕业，被授予“海
上突击队员”称号。据介绍，李烨睿留学的这所特种作战学校，选拔淘汰率高达88.8%
，每年学员的死亡率近3%。留学归来，李烨睿被任命为连长。
李烨睿说，让他感受最深的是淘汰学员最多的瓦斯耐受训练。每天他们都要被扔进一个
不大的加盖密闭深坑，一颗催泪手雷从外扔进来，瓦斯的烟熏让呼吸道和肺部产生剧烈
的疼痛，不住地咳嗽，不少学员的心理防线在这时就崩... 阅读全帖 |
|
