b**********8
发帖数: 349 | 1 有的问题已经在别的帖子里发过了，但是关注度不够，到现在没得到答复，现在贴到这
里归个总，大家一定要帮帮我，凡是看过这个帖子的都给我点意见吧，特别是艳阳天MM
啊，Oncogene版主啊，给点权威的意见吧，小弟先谢谢你们了
问题1，
最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因A后，
对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表达）
。我尝试过两种不同的转染顺序，如下：
1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第
四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左
右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释，
2）考虑到可能是先转染siRNA会影响后续质粒的转染效率。于是换方案，先在6孔板中
铺板，第二天转染质粒，过夜后换液，转染24小时候胰酶消化，将细胞铺到24孔板中，
24小时后再分别转染siControl和siA，出来的结果漂亮多了，至少data不像前一种方案
那么难看了。
我想问一下，第二种方法是否合理，虽然两种方法我都在文献上看到过，但是私以为第
1中方案似乎更为合理，但是在我们的实验中，它对renilla的影响实在太大，是不是
siRNA处理会改变细胞的转染效率？大家遇到这种实验都是怎么做的？
问题2，
手头上有个细胞株，已经是stable transfected clone，G418 resistance（500ug/ml
），现在要转另外一个质粒，使用lipofectamine 2000瞬时转染，在和DNA+lipo孵育的
过程中要不要仍然在medium中加G418，我做过两次转染都加了G418，感觉细胞死亡特别
明显，而且这种死亡即使在换液后仍然持续存在。请问标准的做法应该怎样？可不可以
在细胞与转染复合物孵育的那几个小时里不用向medium里面加G418？然后在换液弃去转
染试剂后再加入G418？谢谢大家关注并提出意见。 |
j****x
发帖数: 1704 | 2 1. 方案2显然更合理，因为你没有设置标定转染效率的内参（如果我没有理解错的话）
，那么先6-well再seed到24well plate实际上是一种标准的近似normalization的处理。
2. Lipo转染过程中毒性物质的效应会被放大，也就是为什么连抗生素都不推荐加。既
然已经stable transfected，自然一般就没那么容易丢，别说就是转染这几个小时，一
个星期不加问题也不大。我手头的一个细胞系，平时传代的时候加G418，真正到了做实
验的时候，都是提前把G418撤掉，免得对assay有不良影响。 |
b**********8
发帖数: 349 | 3
理。
多谢楼上回复，心里有点底了，想给你发个包子，可惜不知道自己有没有包子，也不知
道怎么给你，只好向你说声谢谢了，好人啦~
【在 j****x 的大作中提到】
: 1. 方案2显然更合理，因为你没有设置标定转染效率的内参（如果我没有理解错的话）
: ，那么先6-well再seed到24well plate实际上是一种标准的近似normalization的处理。
: 2. Lipo转染过程中毒性物质的效应会被放大，也就是为什么连抗生素都不推荐加。既
: 然已经stable transfected，自然一般就没那么容易丢，别说就是转染这几个小时，一
: 个星期不加问题也不大。我手头的一个细胞系，平时传代的时候加G418，真正到了做实
: 验的时候，都是提前把G418撤掉，免得对assay有不良影响。
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s******y
发帖数: 28562 | 4 For the first question, transient transfection and expression requires cell
cycle and cell replication.
The KD of your protein A or, the toxic effect of the siRNA, may affect the
cell status, therefore lead to irregular transfection efficiency.
Luciferase reporter is less likely to affect transfection efficiency.
Therefore your second method is probably better. However this is a potential
problem with the second method: are you sure you can KD protein A by such a
short treatment? Also, your luciferase reporter may be too much over
expressed at the time the siRNA effect kick in, leading to potential
artifacts.
Can you do the transfection of your reporter and your siRNA together as a co
-transfection?
For the second question, the other person has already gave you a very good
answer
MM
【在 b**********8 的大作中提到】
: 有的问题已经在别的帖子里发过了，但是关注度不够，到现在没得到答复，现在贴到这
: 里归个总，大家一定要帮帮我，凡是看过这个帖子的都给我点意见吧，特别是艳阳天MM
: 啊，Oncogene版主啊，给点权威的意见吧，小弟先谢谢你们了
: 问题1，
: 最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因A后，
: 对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表达）
: 。我尝试过两种不同的转染顺序，如下：
: 1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第
: 四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左
: 右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释，
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b**********8
发帖数: 349 | 5
cell
potential
a
Many many thanks~
【在 s******y 的大作中提到】
: For the first question, transient transfection and expression requires cell
: cycle and cell replication.
: The KD of your protein A or, the toxic effect of the siRNA, may affect the
: cell status, therefore lead to irregular transfection efficiency.
: Luciferase reporter is less likely to affect transfection efficiency.
: Therefore your second method is probably better. However this is a potential
: problem with the second method: are you sure you can KD protein A by such a
: short treatment? Also, your luciferase reporter may be too much over
: expressed at the time the siRNA effect kick in, leading to potential
: artifacts.
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a***o
发帖数: 271 | 6 敬仰！
MM
【在 b**********8 的大作中提到】
: 有的问题已经在别的帖子里发过了，但是关注度不够，到现在没得到答复，现在贴到这
: 里归个总，大家一定要帮帮我，凡是看过这个帖子的都给我点意见吧，特别是艳阳天MM
: 啊，Oncogene版主啊，给点权威的意见吧，小弟先谢谢你们了
: 问题1，
: 最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因A后，
: 对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表达）
: 。我尝试过两种不同的转染顺序，如下：
: 1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第
: 四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左
: 右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释，
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n******y
发帖数: 128 | |
w*******d
发帖数: 396 | 8 一点建议，谨供参考。
1. co-transfection on day one.
2. a second round of siRNA transfection on day 2.
3. collect lysate for luciferase assay on day 3. |
b**********8
发帖数: 349 | 9
谢谢回复，你这个protocol我们之前也试过，siCONTROL 和 siA的luciferase没差，我
们考虑是siRNA处理的时间太短，A对B的效应还没有出现。我们用qRT-PCR验证过，
siRNA转染后72小时B的mRNA level才有变化。
【在 w*******d 的大作中提到】
: 一点建议，谨供参考。
: 1. co-transfection on day one.
: 2. a second round of siRNA transfection on day 2.
: 3. collect lysate for luciferase assay on day 3.
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