v***a
发帖数: 1242 | 1 第一次做这个，还请大家多多指教。
因为目标蛋白大多在inclusion body里，所以单独分离出并用6 M guanidine溶解后过
柱。洗液1、2、3都含有8 M urea。洗液1不含imidazole，洗液2含10 mM imidazole，
洗液3含25 mM imidazole。最后用含200 mM imidazole的buffer来elute。
纯化后跑胶，发现elute后的蛋白不干净，跟小试相比有很多杂band，不过目标蛋白的
band还是清晰的。问题是洗出液3中含有非常清晰且干净的一条band，赫然在目标蛋白
处。
这是为什么呢？是代表我的目标蛋白在25 mM imidazole时就会被洗脱吗？
谢谢！ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 出现这种情况很正常啊。
因为本来就是一个dynamic competition 的过程，如果你结合在柱上的蛋白
特别多，就是在比较低的浓度的时候就会有蛋白开始被imidazole 置换出来
【在 v***a 的大作中提到】
: 第一次做这个，还请大家多多指教。
: 因为目标蛋白大多在inclusion body里，所以单独分离出并用6 M guanidine溶解后过
: 柱。洗液1、2、3都含有8 M urea。洗液1不含imidazole，洗液2含10 mM imidazole，
: 洗液3含25 mM imidazole。最后用含200 mM imidazole的buffer来elute。
: 纯化后跑胶，发现elute后的蛋白不干净，跟小试相比有很多杂band，不过目标蛋白的
: band还是清晰的。问题是洗出液3中含有非常清晰且干净的一条band，赫然在目标蛋白
: 处。
: 这是为什么呢？是代表我的目标蛋白在25 mM imidazole时就会被洗脱吗？
: 谢谢！
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v***a
发帖数: 1242 | 3 谢谢～
【在 s******y 的大作中提到】
: 出现这种情况很正常啊。
: 因为本来就是一个dynamic competition 的过程，如果你结合在柱上的蛋白
: 特别多，就是在比较低的浓度的时候就会有蛋白开始被imidazole 置换出来
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o*****r
发帖数: 156 | 4 suggestions:
1. dissolve inclusion body w/ 8M urea plus 10mM imidazole to block non-
specifical binding
2. after loading, wash w/ buffer containing 10mM imidazole
3. use 10-300 mM imidazole gradient to elute
Then you should be able to get the pure protein.
btw, don't overload the column.
【在 v***a 的大作中提到】
: 第一次做这个，还请大家多多指教。
: 因为目标蛋白大多在inclusion body里，所以单独分离出并用6 M guanidine溶解后过
: 柱。洗液1、2、3都含有8 M urea。洗液1不含imidazole，洗液2含10 mM imidazole，
: 洗液3含25 mM imidazole。最后用含200 mM imidazole的buffer来elute。
: 纯化后跑胶，发现elute后的蛋白不干净，跟小试相比有很多杂band，不过目标蛋白的
: band还是清晰的。问题是洗出液3中含有非常清晰且干净的一条band，赫然在目标蛋白
: 处。
: 这是为什么呢？是代表我的目标蛋白在25 mM imidazole时就会被洗脱吗？
: 谢谢！
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b*******s
发帖数: 954 | 5 做蛋白出身，实验室有昂贵过蛋白柱子的大侠就不用往下看了。
我半路出家，做了五六年蛋白纯化，走无数弯路。在的实验室也没有特别做蛋白的经验，什么fancy的分蛋白的东东都没有。现在有一点点心得，希望我的经验可以帮楼主少走些弯路。
我的蛋白最早也是在包涵体里，我折腾Urea, 变性复性，整了两年，也没有拿到什么好用的蛋白。
(1)如果楼主需要用蛋白做functional experiment的话，可以试试不用变性复性的办法。降低表达的温度。室温下过夜都可以。如果有条件的话，试试14度。
这样蛋白更有可能是可溶性的。
摸条件时，可以做3ml 的小样，看看在什么样的温度和时间下表达量最高。然后放大表达。
（2）在(1)的低温条件下，多表达一些菌，
我现在实验室条件不好，我每天摇几百毫升菌。离心后冻在-80度。收集到五升以后，在同一天破细菌收蛋白。然后24小时之内连续做实验把蛋白拿到。
(3) 过柱子时不要贪快，让裂解的菌液缓缓流下。
你的蛋白出现在elution 之前的组分里，我猜就是没有挂住。
(4) 洗脱时可以快速，如果你用的是一般的小柱子的话。可以在柱子下面加一根长管子。
good luck!
【在 v***a 的大作中提到】
: 第一次做这个，还请大家多多指教。
: 因为目标蛋白大多在inclusion body里，所以单独分离出并用6 M guanidine溶解后过
: 柱。洗液1、2、3都含有8 M urea。洗液1不含imidazole，洗液2含10 mM imidazole，
: 洗液3含25 mM imidazole。最后用含200 mM imidazole的buffer来elute。
: 纯化后跑胶，发现elute后的蛋白不干净，跟小试相比有很多杂band，不过目标蛋白的
: band还是清晰的。问题是洗出液3中含有非常清晰且干净的一条band，赫然在目标蛋白
: 处。
: 这是为什么呢？是代表我的目标蛋白在25 mM imidazole时就会被洗脱吗？
: 谢谢！
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N******o
发帖数: 3053 | 6 可怜的人儿啊！快毕业，去有钱地方，真是太辛苦了。
我们Lab时间长的人，一个人就要好几根5K刀以上的柱子。
验，什么
fancy的分蛋白的东东都没有。现在有一点点心得，希望我的经验可以帮楼主少走些弯
路。
好用的蛋
白。
法。降低表
达的温度。室温下过夜都可以。如果有条件的话，试试14度。
表达。
，在同一天
破细菌收蛋白。然后24小时之内连续做实验把蛋白拿到。
【在 b*******s 的大作中提到】
: 做蛋白出身，实验室有昂贵过蛋白柱子的大侠就不用往下看了。
: 我半路出家，做了五六年蛋白纯化，走无数弯路。在的实验室也没有特别做蛋白的经验，什么fancy的分蛋白的东东都没有。现在有一点点心得，希望我的经验可以帮楼主少走些弯路。
: 我的蛋白最早也是在包涵体里，我折腾Urea, 变性复性，整了两年，也没有拿到什么好用的蛋白。
: (1)如果楼主需要用蛋白做functional experiment的话，可以试试不用变性复性的办法。降低表达的温度。室温下过夜都可以。如果有条件的话，试试14度。
: 这样蛋白更有可能是可溶性的。
: 摸条件时，可以做3ml 的小样，看看在什么样的温度和时间下表达量最高。然后放大表达。
: （2）在(1)的低温条件下，多表达一些菌，
: 我现在实验室条件不好，我每天摇几百毫升菌。离心后冻在-80度。收集到五升以后，在同一天破细菌收蛋白。然后24小时之内连续做实验把蛋白拿到。
: (3) 过柱子时不要贪快，让裂解的菌液缓缓流下。
: 你的蛋白出现在elution 之前的组分里，我猜就是没有挂住。
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b*******s
发帖数: 954 | 7 谢谢，我在的实验室其实是个Dream Lab. 估计这个世界上比我老板老板更nice更
supportive的老板也屈指可数了。要不也不会给我五六年时间来折腾分蛋白。
俺们实验室只是实在不是个适合做蛋白纯化的地方。呵呵。
【在 N******o 的大作中提到】
: 可怜的人儿啊！快毕业，去有钱地方，真是太辛苦了。
: 我们Lab时间长的人，一个人就要好几根5K刀以上的柱子。
:
: 验，什么
: fancy的分蛋白的东东都没有。现在有一点点心得，希望我的经验可以帮楼主少走些弯
: 路。
: 好用的蛋
: 白。
: 法。降低表
: 达的温度。室温下过夜都可以。如果有条件的话，试试14度。
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