t*****z
发帖数: 1598 | 1 我最近做的一批转基因果蝇，使用一个我们以前都用得好好的载体，有white基因，有
attB位点，定点转到attP2果蝇株系中，然后和yw果蝇杂交后挑红眼睛的后代。以前我
通常20瓶里就能挑到3、4瓶的。但是这次，我挑了几百瓶才挑出一两瓶长红眼睛的，更
有几个重要的系一瓶都没有挑到。所以这下郁闷了。
反复检讨，觉得没有什么地方做错的，唯一和以前的区别在于这回的整个质粒稍微大了
些。以前做过的最大的有14kb，这次的有15-17kb。但是人家上百kb的BAC都能转进去，
我想我们十几kb的不算什么吧。
特此沐浴更衣焚香祝祷上站发贴求救。要是这个技术难关不搞定，我的整个课题就做不
下去了。请问做转基因果蝇有什么需要注意的东西，有什么好的教学网站，特别是有什
么可以提高转染率的窍门吗？祝大家夏日愉快！ |
n**8
发帖数: 221 | 2 这个载体应该很成熟了。
我猜可能还是技术细节吧， DNA quality啊，关键是egg collection，microinjection
的操作要快。
我以前自己inject，拿到transgenic的概率跟你这个差不多，后来送公司做，>10%的转
基因效率。现在公司做一个只要300$左右。 |
a**o
发帖数: 108 | 3 att系统得到一个和得到一堆没啥区别啊。15-17kb的并不大，重新提一下DNA吧。
【在 t*****z 的大作中提到】
: 我最近做的一批转基因果蝇，使用一个我们以前都用得好好的载体，有white基因，有
: attB位点，定点转到attP2果蝇株系中，然后和yw果蝇杂交后挑红眼睛的后代。以前我
: 通常20瓶里就能挑到3、4瓶的。但是这次，我挑了几百瓶才挑出一两瓶长红眼睛的，更
: 有几个重要的系一瓶都没有挑到。所以这下郁闷了。
: 反复检讨，觉得没有什么地方做错的，唯一和以前的区别在于这回的整个质粒稍微大了
: 些。以前做过的最大的有14kb，这次的有15-17kb。但是人家上百kb的BAC都能转进去，
: 我想我们十几kb的不算什么吧。
: 特此沐浴更衣焚香祝祷上站发贴求救。要是这个技术难关不搞定，我的整个课题就做不
: 下去了。请问做转基因果蝇有什么需要注意的东西，有什么好的教学网站，特别是有什
: 么可以提高转染率的窍门吗？祝大家夏日愉快！
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s******s
发帖数: 13035 | 4 没做个att的，只作过puast/p，你这个是不是injection水平太次了？
【在 t*****z 的大作中提到】
: 我最近做的一批转基因果蝇，使用一个我们以前都用得好好的载体，有white基因，有
: attB位点，定点转到attP2果蝇株系中，然后和yw果蝇杂交后挑红眼睛的后代。以前我
: 通常20瓶里就能挑到3、4瓶的。但是这次，我挑了几百瓶才挑出一两瓶长红眼睛的，更
: 有几个重要的系一瓶都没有挑到。所以这下郁闷了。
: 反复检讨，觉得没有什么地方做错的，唯一和以前的区别在于这回的整个质粒稍微大了
: 些。以前做过的最大的有14kb，这次的有15-17kb。但是人家上百kb的BAC都能转进去，
: 我想我们十几kb的不算什么吧。
: 特此沐浴更衣焚香祝祷上站发贴求救。要是这个技术难关不搞定，我的整个课题就做不
: 下去了。请问做转基因果蝇有什么需要注意的东西，有什么好的教学网站，特别是有什
: 么可以提高转染率的窍门吗？祝大家夏日愉快！
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s******s
发帖数: 13035 | 5 我们实验室小韩手工injection，死亡率<10%, 转基因率60%,
那个时候我一直叫着要和他开公司帮别人打果蝇
microinjection
【在 n**8 的大作中提到】
: 这个载体应该很成熟了。
: 我猜可能还是技术细节吧， DNA quality啊，关键是egg collection，microinjection
: 的操作要快。
: 我以前自己inject，拿到transgenic的概率跟你这个差不多，后来送公司做，>10%的转
: 基因效率。现在公司做一个只要300$左右。
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t*****z
发帖数: 1598 | 6 是啊，我们也是让公司做的，以前转染效率很高，就这两批不行。公司是Genetic
Services Inc。DNA我是用QIAGEN的Maxiprep试剂盒提取的，以前都没问题，可不知有
什么地方需要改进的呢？
microinjection
【在 n**8 的大作中提到】
: 这个载体应该很成熟了。
: 我猜可能还是技术细节吧， DNA quality啊，关键是egg collection，microinjection
: 的操作要快。
: 我以前自己inject，拿到transgenic的概率跟你这个差不多，后来送公司做，>10%的转
: 基因效率。现在公司做一个只要300$左右。
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t*****z
发帖数: 1598 | 7 这个太厉害了吧？要不我来做你们的第一个客户吧？
【在 s******s 的大作中提到】
: 我们实验室小韩手工injection，死亡率<10%, 转基因率60%,
: 那个时候我一直叫着要和他开公司帮别人打果蝇
:
: microinjection
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t*****z
发帖数: 1598 | 8 提取DNA可有什么窍门没有？我看来看去就是最后两步：用70％乙醇洗涤，把乙醇晾干
，加水溶解，不大好把握。应该怎么做最好呢？
不到这个时候，我也不会去想要改进工艺啊。人都是逼出来的。 |
a**o
发帖数: 108 | 9 这个我也行。。。。
每个construct打20～30个egg足够了。
【在 s******s 的大作中提到】
: 我们实验室小韩手工injection，死亡率<10%, 转基因率60%,
: 那个时候我一直叫着要和他开公司帮别人打果蝇
:
: microinjection
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s******s
发帖数: 13035 | 10 你们都很牛。我一般要打一排七八十个，大概10%－20%。
【在 a**o 的大作中提到】
: 这个我也行。。。。
: 每个construct打20～30个egg足够了。
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s******s
发帖数: 13035 | 11 我们用qiagen midi, 好像其他公司的midi做出来的不太好。
溶解用milliQ water，有的实验室还有专门的buffer
【在 t*****z 的大作中提到】
: 提取DNA可有什么窍门没有？我看来看去就是最后两步：用70％乙醇洗涤，把乙醇晾干
: ，加水溶解，不大好把握。应该怎么做最好呢？
: 不到这个时候，我也不会去想要改进工艺啊。人都是逼出来的。
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m*****m
发帖数: 101 | 12 我们用同样一个公司注射的，公司操作没有什么问题。质粒大了一定要多给DNA去注射
。别看只大了10-20%，区别非常大，你再注射一次试一试，DNA 总量加一倍。 |
t*****z
发帖数: 1598 | |
t*****z
发帖数: 1598 | 14 原来是这样啊。按我原来的理解，他们会重新纯化送过去的DNA，弄一部分来注射。你
说的DNA总量指的是用来注射的DNA的浓度吗？
【在 m*****m 的大作中提到】
: 我们用同样一个公司注射的，公司操作没有什么问题。质粒大了一定要多给DNA去注射
: 。别看只大了10-20%，区别非常大，你再注射一次试一试，DNA 总量加一倍。
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