t*****z 发帖数: 1598 | 1 我最近做的一批转基因果蝇,使用一个我们以前都用得好好的载体,有white基因,有
attB位点,定点转到attP2果蝇株系中,然后和yw果蝇杂交后挑红眼睛的后代。以前我
通常20瓶里就能挑到3、4瓶的。但是这次,我挑了几百瓶才挑出一两瓶长红眼睛的,更
有几个重要的系一瓶都没有挑到。所以这下郁闷了。
反复检讨,觉得没有什么地方做错的,唯一和以前的区别在于这回的整个质粒稍微大了
些。以前做过的最大的有14kb,这次的有15-17kb。但是人家上百kb的BAC都能转进去,
我想我们十几kb的不算什么吧。
特此沐浴更衣焚香祝祷上站发贴求救。要是这个技术难关不搞定,我的整个课题就做不
下去了。请问做转基因果蝇有什么需要注意的东西,有什么好的教学网站,特别是有什
么可以提高转染率的窍门吗?祝大家夏日愉快! |
n**8 发帖数: 221 | 2 这个载体应该很成熟了。
我猜可能还是技术细节吧, DNA quality啊,关键是egg collection,microinjection
的操作要快。
我以前自己inject,拿到transgenic的概率跟你这个差不多,后来送公司做,>10%的转
基因效率。现在公司做一个只要300$左右。 |
a**o 发帖数: 108 | 3 att系统得到一个和得到一堆没啥区别啊。15-17kb的并不大,重新提一下DNA吧。
【在 t*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近做的一批转基因果蝇,使用一个我们以前都用得好好的载体,有white基因,有 : attB位点,定点转到attP2果蝇株系中,然后和yw果蝇杂交后挑红眼睛的后代。以前我 : 通常20瓶里就能挑到3、4瓶的。但是这次,我挑了几百瓶才挑出一两瓶长红眼睛的,更 : 有几个重要的系一瓶都没有挑到。所以这下郁闷了。 : 反复检讨,觉得没有什么地方做错的,唯一和以前的区别在于这回的整个质粒稍微大了 : 些。以前做过的最大的有14kb,这次的有15-17kb。但是人家上百kb的BAC都能转进去, : 我想我们十几kb的不算什么吧。 : 特此沐浴更衣焚香祝祷上站发贴求救。要是这个技术难关不搞定,我的整个课题就做不 : 下去了。请问做转基因果蝇有什么需要注意的东西,有什么好的教学网站,特别是有什 : 么可以提高转染率的窍门吗?祝大家夏日愉快!
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s******s 发帖数: 13035 | 4 没做个att的,只作过puast/p,你这个是不是injection水平太次了?
【在 t*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近做的一批转基因果蝇,使用一个我们以前都用得好好的载体,有white基因,有 : attB位点,定点转到attP2果蝇株系中,然后和yw果蝇杂交后挑红眼睛的后代。以前我 : 通常20瓶里就能挑到3、4瓶的。但是这次,我挑了几百瓶才挑出一两瓶长红眼睛的,更 : 有几个重要的系一瓶都没有挑到。所以这下郁闷了。 : 反复检讨,觉得没有什么地方做错的,唯一和以前的区别在于这回的整个质粒稍微大了 : 些。以前做过的最大的有14kb,这次的有15-17kb。但是人家上百kb的BAC都能转进去, : 我想我们十几kb的不算什么吧。 : 特此沐浴更衣焚香祝祷上站发贴求救。要是这个技术难关不搞定,我的整个课题就做不 : 下去了。请问做转基因果蝇有什么需要注意的东西,有什么好的教学网站,特别是有什 : 么可以提高转染率的窍门吗?祝大家夏日愉快!
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s******s 发帖数: 13035 | 5 我们实验室小韩手工injection,死亡率<10%, 转基因率60%,
那个时候我一直叫着要和他开公司帮别人打果蝇
microinjection
【在 n**8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个载体应该很成熟了。 : 我猜可能还是技术细节吧, DNA quality啊,关键是egg collection,microinjection : 的操作要快。 : 我以前自己inject,拿到transgenic的概率跟你这个差不多,后来送公司做,>10%的转 : 基因效率。现在公司做一个只要300$左右。
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t*****z 发帖数: 1598 | 6 是啊,我们也是让公司做的,以前转染效率很高,就这两批不行。公司是Genetic
Services Inc。DNA我是用QIAGEN的Maxiprep试剂盒提取的,以前都没问题,可不知有
什么地方需要改进的呢?
microinjection
【在 n**8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个载体应该很成熟了。 : 我猜可能还是技术细节吧, DNA quality啊,关键是egg collection,microinjection : 的操作要快。 : 我以前自己inject,拿到transgenic的概率跟你这个差不多,后来送公司做,>10%的转 : 基因效率。现在公司做一个只要300$左右。
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t*****z 发帖数: 1598 | 7 这个太厉害了吧?要不我来做你们的第一个客户吧?
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我们实验室小韩手工injection,死亡率<10%, 转基因率60%, : 那个时候我一直叫着要和他开公司帮别人打果蝇 : : microinjection
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t*****z 发帖数: 1598 | 8 提取DNA可有什么窍门没有?我看来看去就是最后两步:用70%乙醇洗涤,把乙醇晾干
,加水溶解,不大好把握。应该怎么做最好呢?
不到这个时候,我也不会去想要改进工艺啊。人都是逼出来的。 |
a**o 发帖数: 108 | 9 这个我也行。。。。
每个construct打20~30个egg足够了。
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我们实验室小韩手工injection,死亡率<10%, 转基因率60%, : 那个时候我一直叫着要和他开公司帮别人打果蝇 : : microinjection
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s******s 发帖数: 13035 | 10 你们都很牛。我一般要打一排七八十个,大概10%-20%。
【在 a**o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个我也行。。。。 : 每个construct打20~30个egg足够了。
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s******s 发帖数: 13035 | 11 我们用qiagen midi, 好像其他公司的midi做出来的不太好。
溶解用milliQ water,有的实验室还有专门的buffer
【在 t*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 提取DNA可有什么窍门没有?我看来看去就是最后两步:用70%乙醇洗涤,把乙醇晾干 : ,加水溶解,不大好把握。应该怎么做最好呢? : 不到这个时候,我也不会去想要改进工艺啊。人都是逼出来的。
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m*****m 发帖数: 101 | 12 我们用同样一个公司注射的,公司操作没有什么问题。质粒大了一定要多给DNA去注射
。别看只大了10-20%,区别非常大,你再注射一次试一试,DNA 总量加一倍。 |
t*****z 发帖数: 1598 | |
t*****z 发帖数: 1598 | 14 原来是这样啊。按我原来的理解,他们会重新纯化送过去的DNA,弄一部分来注射。你
说的DNA总量指的是用来注射的DNA的浓度吗?
【在 m*****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我们用同样一个公司注射的,公司操作没有什么问题。质粒大了一定要多给DNA去注射 : 。别看只大了10-20%,区别非常大,你再注射一次试一试,DNA 总量加一倍。
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