T*********y 发帖数: 643 | 1 正研究的一个蛋白有1500多个氨基酸,实验室一个博后原来合成10几个氨基酸的多肽打
兔子,没有得到好的抗体。因为我们希望得到很好的抗体做immunostaining,所以对抗
体的要求比较高。我现在打算从中选取个200-300aa长的两个片段,分别克隆到表达载
体中,然后细菌中表达纯化蛋白,然后送给公司制备两个多抗。我现在的问题是,如何
选取适合的蛋白片段?我所知道的是:1)选取的片段尽量不要含有非常保守的结构域
;2)选取的片段亲水性高,暴露在蛋白的表面。请问还有哪些其它因素需要考虑的?
另外有没有免费好用的软件可以预测抗原决定簇(epitope)?有这方面经验的朋友出
来指导一下,谢谢。 |
f**6 发帖数: 16 | 2 多抗? 还是单抗? 多抗,跑SDS-PAGE,将要的蛋白条带切下,直接免疫兔子,就可得
到多抗血清。单抗,另当别论。别太迷信软件,那是别人用来捣江湖的。如果做单抗的
话,可站内联系。 |
s******s 发帖数: 13035 | 3 都是这么说,不过我做过一些抗体的经验是,割胶出来免疫的抗体一般很脏,
最好的还是溶解在buffer里面的抗原。加tag的经验是gst虽然比较大,但是
效果最好。片段设计直接去问打兔子的公司,他们比较有经验
【在 f**6 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 多抗? 还是单抗? 多抗,跑SDS-PAGE,将要的蛋白条带切下,直接免疫兔子,就可得 : 到多抗血清。单抗,另当别论。别太迷信软件,那是别人用来捣江湖的。如果做单抗的 : 话,可站内联系。
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F**********6 发帖数: 90 | 4 I usually use 6XHIS tagged fusion protein (200-300aa) as an antigen to
immunize rabbit and at least 2 fragments are used for each gene.
So far I've got immunostaining-grade antiserum for several genes. |
v***a 发帖数: 1242 | 5 我做过一次,是选取了功能结构域,比如我已知此蛋白会bind到另一个蛋白,而且这是
它的主要功能之一,我就选取了这个binding domain。
仅供参考。
【在 T*********y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 正研究的一个蛋白有1500多个氨基酸,实验室一个博后原来合成10几个氨基酸的多肽打 : 兔子,没有得到好的抗体。因为我们希望得到很好的抗体做immunostaining,所以对抗 : 体的要求比较高。我现在打算从中选取个200-300aa长的两个片段,分别克隆到表达载 : 体中,然后细菌中表达纯化蛋白,然后送给公司制备两个多抗。我现在的问题是,如何 : 选取适合的蛋白片段?我所知道的是:1)选取的片段尽量不要含有非常保守的结构域 : ;2)选取的片段亲水性高,暴露在蛋白的表面。请问还有哪些其它因素需要考虑的? : 另外有没有免费好用的软件可以预测抗原决定簇(epitope)?有这方面经验的朋友出 : 来指导一下,谢谢。
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j****x 发帖数: 1704 | 6 一般公司都可以提供rational antigen design的服务,从序列中特征性选取多肽片段
然后交联到BSA等载体蛋白上再制备单抗或多抗。如果目标蛋白是有三级结构信息的,
这种表位预测+多肽免疫的成功率很高,一般在70%-80%以上。即便没有高级结构信息,
有经验的设计分析人员也可以将成功率控制在50%左右,一般而言选取2-3条多肽序列就
能至少有一个能制备出不错的抗体。我们这里有core facility专门提供这种服务,这
个技术本身应该说很成熟了。
自己原核表达纯化蛋白的部分片段自然也是一个选择,以前大部分人都不纯化而只是切
胶直接免疫,取决于你要做什么样的staining了,要求抗体特异性好的,就不建议这么
做了,光做western的话还凑合。 |