s******y
发帖数: 220 | 1 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
谢谢了。 |
D*a
发帖数: 6830 | 2 Quick Tail Prep
Collect mice figure/tail in 0.5 ml Eppendorf tube. (4 mm is enough)
Add 100 microliter of quick tail digestion buffer (below).
Incubate at 55 C for 2 hours to overnight.
Vortex and incubate at 95 C for 10 minutes.
Centrifuge for 5 minutes to get rid of the small pieces of undigested sample.
(NOTE: I do neither vortex nor centifuge, and my pcr works
but if you vortex, you have to centifuge)
Use 1-2 microliter aliquot of supernatant for a 25-50 microliter PCR
reaction (or whatever you routinely do).
the dna in this buffer is stable at least for 1 month (from my experience)
Quick Tail Digestion Buffer
50 mM KCl
10 mM Tris HCl, pH 9.0
0.1% Triton X-100
Add 0.4 mg/ml proteinase K just before use. |
r***e
发帖数: 2539 | 3 我一般用1-2%你说的PK浓度。
【在 s******y 的大作中提到】
: 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
: 鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
: 请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
: 谢谢了。
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s******r
发帖数: 2876 | 4 给你一个最便宜的，
0.05M NaOH, 50 ul, 煮10分钟，加50 ul 0.1M Tris/HCL pH6.8中和。
离心，取2ul PCR(50ul total reaction)。
用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
谢谢了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
: 鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
: 请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
: 谢谢了。
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h******y
发帖数: 351 | 5 This is the simplest way and works for all kinds of samples (cells, tissue, E coli, etc).
BTW, it should be 50mM NaOH.
【在 s******r 的大作中提到】
: 给你一个最便宜的，
: 0.05M NaOH, 50 ul, 煮10分钟，加50 ul 0.1M Tris/HCL pH6.8中和。
: 离心，取2ul PCR(50ul total reaction)。
:
: 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
: 鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
: 请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
: 谢谢了。
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s******r
发帖数: 2876 | 6 typo，
改了。
, E coli, etc).
【在 h******y 的大作中提到】
: This is the simplest way and works for all kinds of samples (cells, tissue, E coli, etc).
: BTW, it should be 50mM NaOH.
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C*********u
发帖数: 811 | 7 这个可真便宜。。。
感谢共享
【在 s******r 的大作中提到】
: 给你一个最便宜的，
: 0.05M NaOH, 50 ul, 煮10分钟，加50 ul 0.1M Tris/HCL pH6.8中和。
: 离心，取2ul PCR(50ul total reaction)。
:
: 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
: 鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
: 请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
: 谢谢了。
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g**********r
发帖数: 605 | 8 很经济实用。
【在 s******r 的大作中提到】
: 给你一个最便宜的，
: 0.05M NaOH, 50 ul, 煮10分钟，加50 ul 0.1M Tris/HCL pH6.8中和。
: 离心，取2ul PCR(50ul total reaction)。
:
: 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
: 鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
: 请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
: 谢谢了。
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a*****g
发帖数: 543 | 9 proteinase K还是很便宜的吧？
这样出来的Quality能好很多。
曾经用过一个植物提取DNA的方法，NaOH 煮10分钟，加HCL中和， 直接用来做PCR。 不
记得浓度了（应该是1N左右）。
这样的quality很差，尤其是false negative.
【在 s******y 的大作中提到】
: 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
: 鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
: 请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
: 谢谢了。
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s******s
发帖数: 13035 | 10 kao, proteinase K 100块钱不到能买100mg （sigma)，你这个老鼠能搞250个，
要省钱这个也省不出来啊
【在 s******y 的大作中提到】
: 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
: 鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
: 请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
: 谢谢了。
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s******y
发帖数: 220 | 11 谢谢分享，不过我这个pcr比较tricky， 用kit提取的dna都跑不出来，用你这个方法试
试效果和kit差不多，
but still, thank you.
【在 s******r 的大作中提到】
: 给你一个最便宜的，
: 0.05M NaOH, 50 ul, 煮10分钟，加50 ul 0.1M Tris/HCL pH6.8中和。
: 离心，取2ul PCR(50ul total reaction)。
:
: 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
: 鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
: 请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
: 谢谢了。
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s******y
发帖数: 220 | 12 谢谢，这个和我用的protocol差不多，更简单一些，试试看！
sample.
【在 D*a 的大作中提到】
: Quick Tail Prep
: Collect mice figure/tail in 0.5 ml Eppendorf tube. (4 mm is enough)
: Add 100 microliter of quick tail digestion buffer (below).
: Incubate at 55 C for 2 hours to overnight.
: Vortex and incubate at 95 C for 10 minutes.
: Centrifuge for 5 minutes to get rid of the small pieces of undigested sample.
: (NOTE: I do neither vortex nor centifuge, and my pcr works
: but if you vortex, you have to centifuge)
: Use 1-2 microliter aliquot of supernatant for a 25-50 microliter PCR
: reaction (or whatever you routinely do).
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s******y
发帖数: 220 | 13 1% 就可以了吗？
我换了个公司的PK， invitrogen到amresco，现在都不work了，
也不知道是不是amresco那个坏了不。
【在 r***e 的大作中提到】
: 我一般用1-2%你说的PK浓度。
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s******y
发帖数: 220 | 14 agree
【在 a*****g 的大作中提到】
: proteinase K还是很便宜的吧？
: 这样出来的Quality能好很多。
: 曾经用过一个植物提取DNA的方法，NaOH 煮10分钟，加HCL中和， 直接用来做PCR。 不
: 记得浓度了（应该是1N左右）。
: 这样的quality很差，尤其是false negative.
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s******y
发帖数: 220 | 15 agree， 试图省三十刀买个便宜的pk都不work了， 坑爹：（
【在 s******s 的大作中提到】
: kao, proteinase K 100块钱不到能买100mg （sigma)，你这个老鼠能搞250个，
: 要省钱这个也省不出来啊
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s******y
发帖数: 220 | 16 PK很容易坏吗？
我新买的amresco的好像就坏了，
PK 买液体好还是粉末好呢？
谢谢。
sample.
【在 D*a 的大作中提到】
: Quick Tail Prep
: Collect mice figure/tail in 0.5 ml Eppendorf tube. (4 mm is enough)
: Add 100 microliter of quick tail digestion buffer (below).
: Incubate at 55 C for 2 hours to overnight.
: Vortex and incubate at 95 C for 10 minutes.
: Centrifuge for 5 minutes to get rid of the small pieces of undigested sample.
: (NOTE: I do neither vortex nor centifuge, and my pcr works
: but if you vortex, you have to centifuge)
: Use 1-2 microliter aliquot of supernatant for a 25-50 microliter PCR
: reaction (or whatever you routinely do).
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l****i
发帖数: 20439 | 17 50ul total reaction太浪费了 20ul就足够..
【在 s******r 的大作中提到】
: 给你一个最便宜的，
: 0.05M NaOH, 50 ul, 煮10分钟，加50 ul 0.1M Tris/HCL pH6.8中和。
: 离心，取2ul PCR(50ul total reaction)。
:
: 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
: 鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
: 请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
: 谢谢了。
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M*****n
发帖数: 16729 | 18 THIS WORKS.
I JUST GENOTYPED ABOUT 200 SAMPLES THIS PAST WEEKEND.
【在 s******r 的大作中提到】
: 给你一个最便宜的，
: 0.05M NaOH, 50 ul, 煮10分钟，加50 ul 0.1M Tris/HCL pH6.8中和。
: 离心，取2ul PCR(50ul total reaction)。
:
: 用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
: 鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
: 请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
: 谢谢了。
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D*a
发帖数: 6830 | 19 我们用的貌似是invitrogen的液体的，明天去看看。不容易坏啊，酶不都是一放好几年
么。
你这个如果还想省钱也可以加70微升，甚至更少，有时候我配好mix分配的时候最后不
够了，我就这么干。
好像你还有genotype的pcr问题？也可以试试重新设计PCR啊。你的primer跑质粒很清晰
么？
【在 s******y 的大作中提到】
: PK很容易坏吗？
: 我新买的amresco的好像就坏了，
: PK 买液体好还是粉末好呢？
: 谢谢。
:
: sample.
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s******r
发帖数: 2876 | 20 那你可能要优化PCR。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢分享，不过我这个pcr比较tricky， 用kit提取的dna都跑不出来，用你这个方法试
: 试效果和kit差不多，
: but still, thank you.
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m*****u
发帖数: 15526 | 21 PCR反应条件的问题。加Mg和DMSO试试。不想费事的，用clontech的Terra PCR mix,连
DNA都不用提，切尾巴尖直接p,我用还没有不出结果的
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢分享，不过我这个pcr比较tricky， 用kit提取的dna都跑不出来，用你这个方法试
: 试效果和kit差不多，
: but still, thank you.
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s******y
发帖数: 220 | 22 我用的旧的也是invitrogen的，很好用，换了就不行了：（
我这个pcr 优化好久了，不想花太大力气，搞成纯种了没准就能用简单dna extraction
protocol了。
用麻烦方法提出的dna跑带很清晰，用简单方法提的dna跑就是smear：（
谢谢老鼠女王～
【在 D*a 的大作中提到】
: 我们用的貌似是invitrogen的液体的，明天去看看。不容易坏啊，酶不都是一放好几年
: 么。
: 你这个如果还想省钱也可以加70微升，甚至更少，有时候我配好mix分配的时候最后不
: 够了，我就这么干。
: 好像你还有genotype的pcr问题？也可以试试重新设计PCR啊。你的primer跑质粒很清晰
: 么？
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s******y
发帖数: 220 | 23 恩， 我请教过centuribob前辈优化了。
【在 s******r 的大作中提到】
: 那你可能要优化PCR。
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