v*******3 发帖数: 119 | 1 CHIP已经作了块3个月了,
全程基本自己摸索
用的是cell signal chip kit及抗体,新鲜
问题一直在:
预实验作了很多,IgG (negative control) and H3(positive control) 有显著差异,
但是其它磷酸化组蛋白与转录因子均与IgG类似或者持平或更低
2. 实验用的是 1% formadehyde固定10分钟,全程按照kit说明书来,而且适当改进重要
步骤(如 increase cross link reverse time, 减少洗得次数)
3. 用的都是全都是cell signal 抗体, 并在非 cross link情况下,用WB证实可用
4. sonication后电泳证实DNA片断200-1000 bp间,符合要求,无气泡
所以现在我自己的猜想:
1. cross link mask the epitope of antigen, resulting no antibody binding
2. 1% formadehyde is too low, should increase to 1.5 or 1.8 %(有文献支持)
3. sonication still too powerful
4. .....(请大家补充)
我想请教一下大家看一下可能存在的问题在哪里
先一步要如何改经?
谢谢 | a****o 发帖数: 1786 | 2 WB好的抗体 ChIP未必好
Histone的抗体UpState的很好, 很多可用于ChIP
如果MammalianCells,10分钟应该够了
你用的抗体如果文献中没人用过,可能是抗体的问题
你选的DNA区域,你确信一定有差异吗?
如果IP下来的DNA太少,Ct值太高也不可靠
异,
【在 v*******3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : CHIP已经作了块3个月了, : 全程基本自己摸索 : 用的是cell signal chip kit及抗体,新鲜 : 问题一直在: : 预实验作了很多,IgG (negative control) and H3(positive control) 有显著差异, : 但是其它磷酸化组蛋白与转录因子均与IgG类似或者持平或更低 : 2. 实验用的是 1% formadehyde固定10分钟,全程按照kit说明书来,而且适当改进重要 : 步骤(如 increase cross link reverse time, 减少洗得次数) : 3. 用的都是全都是cell signal 抗体, 并在非 cross link情况下,用WB证实可用 : 4. sonication后电泳证实DNA片断200-1000 bp间,符合要求,无气泡
| D******9 发帖数: 2665 | 3 建议用UPSTATE的抗体和Agilent的protocol 试试 | v*******3 发帖数: 119 | 4
我的抗体文献有人用过,而且不少,所以这个排出
DNA区域我不确定有无差别,所以这个也有可能,
IP下来的DNA基本都是5ng/ul,CT值基本都在35-38左右
不知道您怎么看这些
谢谢
【在 a****o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : WB好的抗体 ChIP未必好 : Histone的抗体UpState的很好, 很多可用于ChIP : 如果MammalianCells,10分钟应该够了 : 你用的抗体如果文献中没人用过,可能是抗体的问题 : 你选的DNA区域,你确信一定有差异吗? : 如果IP下来的DNA太少,Ct值太高也不可靠 : : 异,
| v*******3 发帖数: 119 | 5
能给个连接或者发给我吗
我好像找不到
谢谢
【在 D******9 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 建议用UPSTATE的抗体和Agilent的protocol 试试
| a**********s 发帖数: 8 | 6 说下自己的经验
首先建议用millipore(就是upstate,他们的histone antibody挺好用)的antibodies。
但现在不一定是antibodies的问题,有没有已知的某些gene promoter区域会有你要看
的transcription factor的binding site?你可以先看看在那些区域有没有positive的
binding,这样就可以大致判断你的IP是不是成功的。 |
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