v*******3
发帖数: 119 | 1 CHIP已经作了块3个月了,
全程基本自己摸索
用的是cell signal chip kit及抗体,新鲜
问题一直在:
预实验作了很多,IgG (negative control) and H3(positive control) 有显著差异,
但是其它磷酸化组蛋白与转录因子均与IgG类似或者持平或更低
2. 实验用的是 1% formadehyde固定10分钟,全程按照kit说明书来,而且适当改进重要
步骤(如 increase cross link reverse time, 减少洗得次数)
3. 用的都是全都是cell signal 抗体, 并在非 cross link情况下，用WB证实可用
4. sonication后电泳证实DNA片断200-1000 bp间,符合要求，无气泡
所以现在我自己的猜想:
1. cross link mask the epitope of antigen, resulting no antibody binding
2. 1% formadehyde is too low, should increase to 1.5 or 1.8 %(有文献支持)
3. sonication still too powerful
4. .....(请大家补充）
我想请教一下大家看一下可能存在的问题在哪里
先一步要如何改经?
谢谢 | a****o
发帖数: 1786 | 2 WB好的抗体 ChIP未必好
Histone的抗体UpState的很好， 很多可用于ChIP
如果MammalianCells，10分钟应该够了
你用的抗体如果文献中没人用过，可能是抗体的问题
你选的DNA区域，你确信一定有差异吗？
如果IP下来的DNA太少，Ct值太高也不可靠
异,
【在 v*******3 的大作中提到】
: CHIP已经作了块3个月了,
: 全程基本自己摸索
: 用的是cell signal chip kit及抗体,新鲜
: 问题一直在:
: 预实验作了很多,IgG (negative control) and H3(positive control) 有显著差异,
: 但是其它磷酸化组蛋白与转录因子均与IgG类似或者持平或更低
: 2. 实验用的是 1% formadehyde固定10分钟,全程按照kit说明书来,而且适当改进重要
: 步骤(如 increase cross link reverse time, 减少洗得次数)
: 3. 用的都是全都是cell signal 抗体, 并在非 cross link情况下，用WB证实可用
: 4. sonication后电泳证实DNA片断200-1000 bp间,符合要求，无气泡
| D******9
发帖数: 2665 | 3 建议用UPSTATE的抗体和Agilent的protocol 试试 | v*******3
发帖数: 119 | 4
我的抗体文献有人用过，而且不少，所以这个排出
DNA区域我不确定有无差别，所以这个也有可能，
IP下来的DNA基本都是5ng/ul，CT值基本都在35-38左右
不知道您怎么看这些
谢谢
【在 a****o 的大作中提到】
: WB好的抗体 ChIP未必好
: Histone的抗体UpState的很好， 很多可用于ChIP
: 如果MammalianCells，10分钟应该够了
: 你用的抗体如果文献中没人用过，可能是抗体的问题
: 你选的DNA区域，你确信一定有差异吗？
: 如果IP下来的DNA太少，Ct值太高也不可靠
:
: 异,
| v*******3
发帖数: 119 | 5
能给个连接或者发给我吗
我好像找不到
谢谢
【在 D******9 的大作中提到】
: 建议用UPSTATE的抗体和Agilent的protocol 试试
| a**********s
发帖数: 8 | 6 说下自己的经验
首先建议用millipore（就是upstate，他们的histone antibody挺好用）的antibodies。
但现在不一定是antibodies的问题，有没有已知的某些gene promoter区域会有你要看
的transcription factor的binding site？你可以先看看在那些区域有没有positive的
binding，这样就可以大致判断你的IP是不是成功的。 |
|
