h**********8 发帖数: 650 | 1 在老罗的贴子里看到关于恩度的问题。说是his tagged 蛋白不能药用,难道切掉tag,
过个胶,不能分离吗?
请大牛们解答:药用蛋白如何纯化?如果有相关书籍,还请推荐! |
j****x 发帖数: 1704 | 2 Therapeutic Proteins : Methods and Protocols
http://www.springerprotocols.com/BookToc/doi/10.1385/1592599222
切掉His-taq再纯化理论上当然没问题,但是存在不少不确定因素:folding、酶切效率
、得率等,当然最最重要的是成本。对罗某某而言,最重要的显然是以最简单的步骤和
最低的成本包装上市,其他的对他而言无足轻重了。 |
s********n 发帖数: 2939 | 3 以前参加GE training的时候问过很多Pharma的人,他们认为Ni leackage是最大问题。 |
a******g 发帖数: 71 | 4 endostatin不是简单地一步Ni柱纯化,据我了解,应该是首先破菌,分离包涵体,充分
洗涤包涵体(洗涤过后纯度就达到90%),然后8M urea溶解,过Ni柱,然后有一步最关
键的refolding,也是罗的技术上最牛的地方。endostatin有一对跨越式disulfide
bond,在体外条件下正确形成非常困难。这一步refolding后,50%以上的endostatin能
以可溶性单体存在,其他不能refold的则聚集形成胶体,经盐诱导沉淀后与refolding
成功的部分分离。最终产品的纯度超过99%,银染无杂带。整个工艺应该还是非常
impressive的。
我也不知道前面为什么有人说his tag非得切掉。
【在 h**********8 的大作中提到】 : 在老罗的贴子里看到关于恩度的问题。说是his tagged 蛋白不能药用,难道切掉tag, : 过个胶,不能分离吗? : 请大牛们解答:药用蛋白如何纯化?如果有相关书籍,还请推荐!
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u*******r 发帖数: 27 | 5 药用蛋白在纯度之外还要要考虑几个重要的问题:
1.immunogenicity
这也就是要切去his的原因,虽然his的免疫原性不高,但是还是有的。这所产生的
immunogenicty不仅使其可能对人体有害,还会complicate the whole efficacy
studies. Is the efficacy coming from the immunogenicity or may be it
compromise the eeficacy?
2. 提存和处理过程中的杂质。
其中包括内毒素,各种病原体等。前面楼提到的ni-leakage也是其中。
其工艺据你的描述也没有什么了不起的。
refolding
【在 a******g 的大作中提到】 : endostatin不是简单地一步Ni柱纯化,据我了解,应该是首先破菌,分离包涵体,充分 : 洗涤包涵体(洗涤过后纯度就达到90%),然后8M urea溶解,过Ni柱,然后有一步最关 : 键的refolding,也是罗的技术上最牛的地方。endostatin有一对跨越式disulfide : bond,在体外条件下正确形成非常困难。这一步refolding后,50%以上的endostatin能 : 以可溶性单体存在,其他不能refold的则聚集形成胶体,经盐诱导沉淀后与refolding : 成功的部分分离。最终产品的纯度超过99%,银染无杂带。整个工艺应该还是非常 : impressive的。 : 我也不知道前面为什么有人说his tag非得切掉。
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a******g 发帖数: 71 | 6 endostatin的refolding是一件极其困难的事情,Folkman最早的paper里他们提到有99%
的蛋白沉淀而无法复性,所以罗的工艺在此处有独到之处。
罗的工艺基本是遵循纯化,复性,再纯化(不依赖Ni柱)的途径,最后产品纯度高当然
不只是蛋白质,并且元素检验也没有Ni残留,至于你说的endotoxin更是检测不出。
如果你不了解具体的过程,就不要着急trivialize别人的东西。
【在 u*******r 的大作中提到】 : 药用蛋白在纯度之外还要要考虑几个重要的问题: : 1.immunogenicity : 这也就是要切去his的原因,虽然his的免疫原性不高,但是还是有的。这所产生的 : immunogenicty不仅使其可能对人体有害,还会complicate the whole efficacy : studies. Is the efficacy coming from the immunogenicity or may be it : compromise the eeficacy? : 2. 提存和处理过程中的杂质。 : 其中包括内毒素,各种病原体等。前面楼提到的ni-leakage也是其中。 : 其工艺据你的描述也没有什么了不起的。 :
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s********n 发帖数: 2939 | 7 既然这么牛为啥不切掉His-tag?
99%
【在 a******g 的大作中提到】 : endostatin的refolding是一件极其困难的事情,Folkman最早的paper里他们提到有99% : 的蛋白沉淀而无法复性,所以罗的工艺在此处有独到之处。 : 罗的工艺基本是遵循纯化,复性,再纯化(不依赖Ni柱)的途径,最后产品纯度高当然 : 不只是蛋白质,并且元素检验也没有Ni残留,至于你说的endotoxin更是检测不出。 : 如果你不了解具体的过程,就不要着急trivialize别人的东西。
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a******g 发帖数: 71 | 8 这是另外一个范畴的问题,与罗的复性工艺本身无关。
【在 s********n 的大作中提到】 : 既然这么牛为啥不切掉His-tag? : : 99%
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u*******r 发帖数: 27 | 9 我没有trivialize。
遇到过一个在他实验室中干过的兄弟,提到其提纯还是运用了Ni柱。此外,所有的蛋白
都是从inclusion body中来,当然在crude solution中就比cytosol中的得到的高。但
是最终产物时常有aggregate,但就是遮着掩着。
99%
【在 a******g 的大作中提到】 : endostatin的refolding是一件极其困难的事情,Folkman最早的paper里他们提到有99% : 的蛋白沉淀而无法复性,所以罗的工艺在此处有独到之处。 : 罗的工艺基本是遵循纯化,复性,再纯化(不依赖Ni柱)的途径,最后产品纯度高当然 : 不只是蛋白质,并且元素检验也没有Ni残留,至于你说的endotoxin更是检测不出。 : 如果你不了解具体的过程,就不要着急trivialize别人的东西。
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a******g 发帖数: 71 | 10 第一步从包涵体中纯化是用Ni柱,第一步结束之后需要透析到酸性环境下除去所有尿素
且确保不沉淀,然后在一个特定配方内进行复性和S-S正确配对,然后有一个再纯化的
过程去除没有复性而聚集的蛋白,这一步不用Ni柱。最终产物走HPLC,走gel
filtration,结果都非常好。
在实验室里,罗从来不会公布复性的方法,因为这个是商业机密,没有哪个学生知道。
【在 u*******r 的大作中提到】 : 我没有trivialize。 : 遇到过一个在他实验室中干过的兄弟,提到其提纯还是运用了Ni柱。此外,所有的蛋白 : 都是从inclusion body中来,当然在crude solution中就比cytosol中的得到的高。但 : 是最终产物时常有aggregate,但就是遮着掩着。 : : 99%
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s********n 发帖数: 2939 | 11 难道复性实验他自己做?
【在 a******g 的大作中提到】 : 第一步从包涵体中纯化是用Ni柱,第一步结束之后需要透析到酸性环境下除去所有尿素 : 且确保不沉淀,然后在一个特定配方内进行复性和S-S正确配对,然后有一个再纯化的 : 过程去除没有复性而聚集的蛋白,这一步不用Ni柱。最终产物走HPLC,走gel : filtration,结果都非常好。 : 在实验室里,罗从来不会公布复性的方法,因为这个是商业机密,没有哪个学生知道。
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a******g 发帖数: 71 | 12 复性实验公司做,样品直接送到实验室。
【在 s********n 的大作中提到】 : 难道复性实验他自己做?
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s********n 发帖数: 2939 | 13 看来老兄很了解他们实验室啊,呵呵。
【在 a******g 的大作中提到】 : 复性实验公司做,样品直接送到实验室。
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s********n 发帖数: 2939 | 14 这个endostatin不能用insect or CHO cell表达吗? |
j****x 发帖数: 1704 | 15 产量和纯化会是更大的问题,成本自然就级数增长了
如果能获得相似活性的蛋白产物,那么显然大肠杆菌表达系统是最佳的选择了
【在 s********n 的大作中提到】 : 这个endostatin不能用insect or CHO cell表达吗?
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u*******r 发帖数: 27 | 16 其学生有去公司中做的。
国内特色之一。
相信在国外的TZ都想国内多做原创性的东西,但是,这是吗?如果真是大牛东西,为什
么这一在美国当年轰动一是的药物,没有人从国内购买。据说当时国外公司要看临床数
据,罗也说是商业机密不给看。是不是什么都可用商业机密一叶遮目。
【在 a******g 的大作中提到】 : 复性实验公司做,样品直接送到实验室。
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a******g 发帖数: 71 | 17 首先这个是extracellular protein,在细胞内还原环境下表达无法形成正确的S-S键配
对。除非弄成分泌到胞外的然后从培养基里纯化。
其次真核表达和大肠感觉相比产量差别太大了,罗生产endostatin是按kilograms来算
的。
【在 s********n 的大作中提到】 : 这个endostatin不能用insect or CHO cell表达吗?
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a******g 发帖数: 71 | 18 也许后来有学生去做复性,那个我并不了解,所以也不好说。
临床数据没有保密,06年罗来Children's hospital Boston做报告,展示了不少三期临
床的数据。一期二期的结果我也都看到过,这个不是保密的。
当然了,效果确实比较modest,并且作用机理不明,其免疫原性是否起作用也不是十分
清楚,并且不能单独用药,需要与taxol联合用。但是所有的蛋白类抗癌药都得和一线
化疗药联合用。
【在 u*******r 的大作中提到】 : 其学生有去公司中做的。 : 国内特色之一。 : 相信在国外的TZ都想国内多做原创性的东西,但是,这是吗?如果真是大牛东西,为什 : 么这一在美国当年轰动一是的药物,没有人从国内购买。据说当时国外公司要看临床数 : 据,罗也说是商业机密不给看。是不是什么都可用商业机密一叶遮目。
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s********n 发帖数: 2939 | 19 这个我当然理解,但是现在大部分的药用蛋白都是CHO cell表达的,虽然成本高,但是
能够正确折叠,而且有正确翻译后修饰。
【在 j****x 的大作中提到】 : 产量和纯化会是更大的问题,成本自然就级数增长了 : 如果能获得相似活性的蛋白产物,那么显然大肠杆菌表达系统是最佳的选择了
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s********n 发帖数: 2939 | 20 insect or CHO cell也是可以分泌表达的。
【在 a******g 的大作中提到】 : 首先这个是extracellular protein,在细胞内还原环境下表达无法形成正确的S-S键配 : 对。除非弄成分泌到胞外的然后从培养基里纯化。 : 其次真核表达和大肠感觉相比产量差别太大了,罗生产endostatin是按kilograms来算 : 的。
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u*******r 发帖数: 27 | 21 的确,CHO可以表达。而且现在由于产量可以达到5g/L, 所以平均生产成本到了30美元
/g,AMGEN还提到其生产成本6美元/g.
另一个问题:endostatin到底有没有效?
【在 s********n 的大作中提到】 : insect or CHO cell也是可以分泌表达的。
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u*******r 发帖数: 27 | 22 国外药物公司要看原始临床数据,而不是整理发表的。
【在 a******g 的大作中提到】 : 也许后来有学生去做复性,那个我并不了解,所以也不好说。 : 临床数据没有保密,06年罗来Children's hospital Boston做报告,展示了不少三期临 : 床的数据。一期二期的结果我也都看到过,这个不是保密的。 : 当然了,效果确实比较modest,并且作用机理不明,其免疫原性是否起作用也不是十分 : 清楚,并且不能单独用药,需要与taxol联合用。但是所有的蛋白类抗癌药都得和一线 : 化疗药联合用。
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a******g 发帖数: 71 | 23 三期临床显示有modest效果。
作用机理不明的状况下,很难对疗效问题作出准确回答。
【在 u*******r 的大作中提到】 : 的确,CHO可以表达。而且现在由于产量可以达到5g/L, 所以平均生产成本到了30美元 : /g,AMGEN还提到其生产成本6美元/g. : 另一个问题:endostatin到底有没有效?
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j****x 发帖数: 1704 | 24 所以我说前提是能获得相似活性的产物啊,如果活性不行,那自然还得真核表达。
举个最简单的例子,重组人干扰素,早期都是大肠杆菌表达,后来真核表达发现活性提
高一千倍有余,dose啊副作用啊显著降低了,那显然用真核表达的好。即便如此,目前
原核表达的一样卖的很好,成本这东西,企业的命门
不过07年国内新版药典颁布后,以后CHO都不让用了,郁闷了一大帮
【在 s********n 的大作中提到】 : 这个我当然理解,但是现在大部分的药用蛋白都是CHO cell表达的,虽然成本高,但是 : 能够正确折叠,而且有正确翻译后修饰。
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a******g 发帖数: 71 | 25 据我所知,Johnson and Johnson已经准备和罗合作开发长效endostatin并在美国开始
上临床实验了,我不知道具体细节但是我猜想中国的原始临床数据他们会要求看的。
【在 u*******r 的大作中提到】 : 国外药物公司要看原始临床数据,而不是整理发表的。
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a**o 发帖数: 108 | 26 这是因为,his-tag可以增加这个蛋白的稳定性。你要是有兴趣可以自己试试。
去掉了his-tag很容易就沉了。
btw,这个蛋白的改造不是罗搞得,是我phd老板做的。他们当时在合作。
【在 s********n 的大作中提到】 : 既然这么牛为啥不切掉His-tag? : : 99%
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s********n 发帖数: 2939 | 27 CHO不让用,那得用啥?
【在 j****x 的大作中提到】 : 所以我说前提是能获得相似活性的产物啊,如果活性不行,那自然还得真核表达。 : 举个最简单的例子,重组人干扰素,早期都是大肠杆菌表达,后来真核表达发现活性提 : 高一千倍有余,dose啊副作用啊显著降低了,那显然用真核表达的好。即便如此,目前 : 原核表达的一样卖的很好,成本这东西,企业的命门 : 不过07年国内新版药典颁布后,以后CHO都不让用了,郁闷了一大帮
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u*******r 发帖数: 27 | 28 5年前就听说要和Pfizer, JJ,Onyx谈了。结果一要原始数据就以商业机密而拒绝。
【在 a******g 的大作中提到】 : 据我所知,Johnson and Johnson已经准备和罗合作开发长效endostatin并在美国开始 : 上临床实验了,我不知道具体细节但是我猜想中国的原始临床数据他们会要求看的。
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s********n 发帖数: 2939 | 29 有意思,不过就不用试了,我也不是做这方面的。只是好奇到时候要FDA approval的时
候可能会很麻烦。
【在 a**o 的大作中提到】 : 这是因为,his-tag可以增加这个蛋白的稳定性。你要是有兴趣可以自己试试。 : 去掉了his-tag很容易就沉了。 : btw,这个蛋白的改造不是罗搞得,是我phd老板做的。他们当时在合作。
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a**o 发帖数: 108 | 30 是挺麻烦的。。。中国当时也挺麻烦的。
大家都知道那玩意有抗原性啊。
不过当时做的时候最初的目的只是提高稳定性,没想一定要做药。
【在 s********n 的大作中提到】 : 有意思,不过就不用试了,我也不是做这方面的。只是好奇到时候要FDA approval的时 : 候可能会很麻烦。
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h**********8 发帖数: 650 | 31 太感谢啦!!!
【在 j****x 的大作中提到】 : Therapeutic Proteins : Methods and Protocols : http://www.springerprotocols.com/BookToc/doi/10.1385/1592599222 : 切掉His-taq再纯化理论上当然没问题,但是存在不少不确定因素:folding、酶切效率 : 、得率等,当然最最重要的是成本。对罗某某而言,最重要的显然是以最简单的步骤和 : 最低的成本包装上市,其他的对他而言无足轻重了。
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h**********8 发帖数: 650 | 32 貌似卖给先声了?
感谢楼上各位大牛科普!!!
【在 u*******r 的大作中提到】 : 5年前就听说要和Pfizer, JJ,Onyx谈了。结果一要原始数据就以商业机密而拒绝。
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