m******5
发帖数: 1383 | 1 网上有两个版本，一个是长版本
ATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACA
CCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGG
TTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTT
GTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
还有一个就是
TTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCA
一般做knock in contruct，是否后一个版本就足够drive knock in RNA 表达？ |
j****x
发帖数: 1704 | 2 想要确保获得有效的RNA Polyadenylation，后一个可能是不够的。
狭义上的polyA signal，指的是RNA序列上的一个Conserved motif: AATAAA（AAUAAA）
。CPSF蛋白识别并结合该位点，在CstF的辅助下切割下游pre-mRNA，再由PAP完成加尾
。当然整个过程还需要其他一系列蛋白因子的共同左右，不细说了。
你的问题涉及到CstF这个关键因子，它识别并结合AATAAA下游一段GU rich region，对
于有效的RNA Polyadenylation processing是不可或缺的，尽管这段序列不像poly
signal motif那样具有比较严格的consensus sequence。而在你的第二个版本中，并没
有包含这段序列。
【在 m******5 的大作中提到】
: 网上有两个版本，一个是长版本
: ATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACA
: CCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGG
: TTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTT
: GTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
: 还有一个就是
: TTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCA
: 一般做knock in contruct，是否后一个版本就足够drive knock in RNA 表达？
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m******5
发帖数: 1383 | 3 非常感谢！
还有一个问题，挺多人设计knock in allelle，往往并未提及如何添加poly A
sequence，在这种情况下是什么原因
【在 j****x 的大作中提到】
: 想要确保获得有效的RNA Polyadenylation，后一个可能是不够的。
: 狭义上的polyA signal，指的是RNA序列上的一个Conserved motif: AATAAA（AAUAAA）
: 。CPSF蛋白识别并结合该位点，在CstF的辅助下切割下游pre-mRNA，再由PAP完成加尾
: 。当然整个过程还需要其他一系列蛋白因子的共同左右，不细说了。
: 你的问题涉及到CstF这个关键因子，它识别并结合AATAAA下游一段GU rich region，对
: 于有效的RNA Polyadenylation processing是不可或缺的，尽管这段序列不像poly
: signal motif那样具有比较严格的consensus sequence。而在你的第二个版本中，并没
: 有包含这段序列。
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m******5
发帖数: 1383 | 4 非常感谢你的提示
根据你的提示读了很多文章，得知GU rich sequence确实对于其process必不可少
但是又有一个很大的疑问：很多内源的polyA signal并不含有GU rich sequence，只有
AATAAA这个conserved motif，下游是一堆随机碱基，请问这种情况下polyA加尾是如何
实现的呢？
这是一个有共识的问题么？或者只是一个伪命题？
【在 j****x 的大作中提到】
: 想要确保获得有效的RNA Polyadenylation，后一个可能是不够的。
: 狭义上的polyA signal，指的是RNA序列上的一个Conserved motif: AATAAA（AAUAAA）
: 。CPSF蛋白识别并结合该位点，在CstF的辅助下切割下游pre-mRNA，再由PAP完成加尾
: 。当然整个过程还需要其他一系列蛋白因子的共同左右，不细说了。
: 你的问题涉及到CstF这个关键因子，它识别并结合AATAAA下游一段GU rich region，对
: 于有效的RNA Polyadenylation processing是不可或缺的，尽管这段序列不像poly
: signal motif那样具有比较严格的consensus sequence。而在你的第二个版本中，并没
: 有包含这段序列。
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j****x
发帖数: 1704 | 5 其实分子生物学的反例太多，所谓规律很大程度上只是基于统计
举个例子，起始ATG有所谓Kozak consensus，但是这也只是大约70%的真核mRNA所“遵
循”的一个规律，仍大量的mRNA不符合这个规则一样可以翻译，甚至翻译的很好。
polyA processing这里是同样的问题，比如AATAAA并不绝对，TATAAA已经其他一些变体
也非常普遍，甚至没有这个polyA signal在下游其他一些motif的帮助下也一样可以完
成。GU rich region就更模糊了，要多少个repeats才算rich，怎么算？从哪里开始算
？这些都并不非常清楚，只能说，基于统计存在这个规律，同时在一些研究的比较透彻
的polyA signal序列中找到了一定的实验证据。至于是不是伪命题，你应该有你自己的
判断。
【在 m******5 的大作中提到】
: 非常感谢你的提示
: 根据你的提示读了很多文章，得知GU rich sequence确实对于其process必不可少
: 但是又有一个很大的疑问：很多内源的polyA signal并不含有GU rich sequence，只有
: AATAAA这个conserved motif，下游是一堆随机碱基，请问这种情况下polyA加尾是如何
: 实现的呢？
: 这是一个有共识的问题么？或者只是一个伪命题？
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m******5
发帖数: 1383 | 6 非常感谢！ 主要是我设计了一个漏掉了GU rich sequence的poly A 在我的knock in
sequence的尾端，现在已经拿到老鼠了，刚意识到这个问题。
现在不知道严重程度，因为还没有检测基因的表达
【在 j****x 的大作中提到】
: 其实分子生物学的反例太多，所谓规律很大程度上只是基于统计
: 举个例子，起始ATG有所谓Kozak consensus，但是这也只是大约70%的真核mRNA所“遵
: 循”的一个规律，仍大量的mRNA不符合这个规则一样可以翻译，甚至翻译的很好。
: polyA processing这里是同样的问题，比如AATAAA并不绝对，TATAAA已经其他一些变体
: 也非常普遍，甚至没有这个polyA signal在下游其他一些motif的帮助下也一样可以完
: 成。GU rich region就更模糊了，要多少个repeats才算rich，怎么算？从哪里开始算
: ？这些都并不非常清楚，只能说，基于统计存在这个规律，同时在一些研究的比较透彻
: 的polyA signal序列中找到了一定的实验证据。至于是不是伪命题，你应该有你自己的
: 判断。
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j****x
发帖数: 1704 | 7 Relax. Life will find a way.
【在 m******5 的大作中提到】
: 非常感谢！ 主要是我设计了一个漏掉了GU rich sequence的poly A 在我的knock in
: sequence的尾端，现在已经拿到老鼠了，刚意识到这个问题。
: 现在不知道严重程度，因为还没有检测基因的表达
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m******5
发帖数: 1383 | 8 Thank you!
【在 j****x 的大作中提到】
: Relax. Life will find a way.
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m******5
发帖数: 1383 | 9 I still want more suggestion |
m******5
发帖数: 1383 | |
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m******5
发帖数: 1383 | |
H*********8
发帖数: 323 | 12 搭车问个问题，我在某个基因内部插入cre 基因，cre基因的终止子后面就没放poly a
，转录出来的mRNA是融合的，翻译成蛋白的时候能不能在cre 终止子处终止翻译呢？
谢谢！ |
j****x
发帖数: 1704 | 13 你这个问题的表述里面基本概率有些问题啊，你说的终止子是指终止密码子吗？如果是
的话，能不能终止要看是否in frame reading
a
【在 H*********8 的大作中提到】
: 搭车问个问题，我在某个基因内部插入cre 基因，cre基因的终止子后面就没放poly a
: ，转录出来的mRNA是融合的，翻译成蛋白的时候能不能在cre 终止子处终止翻译呢？
: 谢谢！
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H*********8
发帖数: 323 | 14 如果是在in frame reading，我就想知道，如果没有poly a，能不能够在终止密码子处
停止翻译。 不要说理论的，我想理论上是可以的。我想知道有没有人有这方面的经历。
【在 j****x 的大作中提到】
: 你这个问题的表述里面基本概率有些问题啊，你说的终止子是指终止密码子吗？如果是
: 的话，能不能终止要看是否in frame reading
:
: a
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j****x
发帖数: 1704 | 15 sorry,你的描述我没看懂。
你的问题如果不能表述清楚，别人没法帮你
历。
【在 H*********8 的大作中提到】
: 如果是在in frame reading，我就想知道，如果没有poly a，能不能够在终止密码子处
: 停止翻译。 不要说理论的，我想理论上是可以的。我想知道有没有人有这方面的经历。
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j****x
发帖数: 1704 | 16 sorry,你的描述我没看懂。
你的问题如果不能表述清楚，别人没法帮你
历。
【在 H*********8 的大作中提到】
: 如果是在in frame reading，我就想知道，如果没有poly a，能不能够在终止密码子处
: 停止翻译。 不要说理论的，我想理论上是可以的。我想知道有没有人有这方面的经历。
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m******5
发帖数: 1383 | 17 我觉得这里就不是inframe 不inframe的问题了
你的cre前面如果没有IRES根本就没机会表达
如果有IRES，polya和translation是否终止没关系
历。
【在 H*********8 的大作中提到】
: 如果是在in frame reading，我就想知道，如果没有poly a，能不能够在终止密码子处
: 停止翻译。 不要说理论的，我想理论上是可以的。我想知道有没有人有这方面的经历。
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