a***d
发帖数: 1998 | 1 我现在有个质粒，想用PCR的方法在target sequence两头加两个restriction sites，
然后再把target sequence切下来派用场。请问我必须作两次PCR，产物分别重提质粒，
最后酶切目标序列，与目标vector相连吗？
或者可不可以我只作一次PCR（用两个PRIMER），PCR产物直接酶切。再和目标vector相
连呢？ |
I***a
发帖数: 13467 | 2 一次PCR（用两个PRIMER），PCR产物直接酶切。再和目标vector相
连 |
C*********u
发帖数: 811 | 3 一次PCR就够了
除非你要加的东西太长
【在 a***d 的大作中提到】
: 我现在有个质粒，想用PCR的方法在target sequence两头加两个restriction sites，
: 然后再把target sequence切下来派用场。请问我必须作两次PCR，产物分别重提质粒，
: 最后酶切目标序列，与目标vector相连吗？
: 或者可不可以我只作一次PCR（用两个PRIMER），PCR产物直接酶切。再和目标vector相
: 连呢？
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o*****r
发帖数: 156 | 4 Yes.
另外，primer设计的时候，两边的酶切位点旁边都要多放几个，这样酶切效率会高一些
。 我通常两边都加8个（atcgatcg）
【在 I***a 的大作中提到】
: 一次PCR（用两个PRIMER），PCR产物直接酶切。再和目标vector相
: 连
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s******s
发帖数: 13035 | 5 这个去查NEB的catalog, 里面会告诉加几个的，各个酶不一样
【在 o*****r 的大作中提到】
: Yes.
: 另外，primer设计的时候，两边的酶切位点旁边都要多放几个，这样酶切效率会高一些
: 。 我通常两边都加8个（atcgatcg）
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