e****p
发帖数: 354 | 1 要CLONE 一段CDNA 的重复序列片段，大概4K, 怎么PCR也P不出来，基因组上面这个物
种的这个位置是2个GAP
除了SCREEN CDNA library,请问有没有其他的办法？
谢谢！ |
m***c
发帖数: 177 | 2 What do you mean the 'CDNA 的重复序列片段'? |
e****p
发帖数: 354 | 3 就是那一段都是tandem repeats 而且不是完全一样的重复
比如可能 acagacag atagacag acagacag acagacag
实在想不出好办法
【在 m***c 的大作中提到】
: What do you mean the 'CDNA 的重复序列片段'?
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b****r
发帖数: 17995 | 4 几个办法咯
一个是换酶，似乎有些酶对重复片段是比较有效的，特别是高保真类的，一个是
nesting PCR。当然，前提是你已经确实试过很多种PCR条件都不行的情况下，比如hot
start啊，shuttle PCR之类 。重复片段我觉得可能P出错误，但是一般不会很难P，难P
的一般是CG含量超高的 |
s******s
发帖数: 13035 | 5 是cDNA里面有重复，还是你的primer在重复区？
我以前p过一下里面无数重复序列的amplicon，没啥问题；要是你的primer有问题，
可以做一个nested, 外面p好克隆好，然后换你的引物
【在 e****p 的大作中提到】
: 要CLONE 一段CDNA 的重复序列片段，大概4K, 怎么PCR也P不出来，基因组上面这个物
: 种的这个位置是2个GAP
: 除了SCREEN CDNA library,请问有没有其他的办法？
: 谢谢！
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e****p
发帖数: 354 | 6 酶试了几种高保真的 PFU等 还有什么MIX的酶
是对，引物很不好设计。引物也试了几对， 外围的引物弄过一对，有SMEAR 但预期是
是5-6K开始SMEAR, 结果是1K开始SMEAR DOWN, NESTED 就是更短的100，200 BP 的几个
产物。不知道怎么回事？
shuttle pcr 是什么到时没有试过 |
b****r
发帖数: 17995 | 7 或者直接买openbiosystem之类公司的cDNA clone然后切得了，折腾啥 |
