m******5
发帖数: 1383 | 1 前的状况是单酶切AGEI,用T4ligase过夜后转化
菌系试过DH5alpha和Top 10。
所有连接都是反向的。
目前的情况是质粒没法做任何改动，只能在insert上做手脚，但问题是不知道症结在哪
里从何改其 |
s******s
发帖数: 13035 | 2 什么叫做所有，你抽了几个？
【在 m******5 的大作中提到】
: 前的状况是单酶切AGEI,用T4ligase过夜后转化
: 菌系试过DH5alpha和Top 10。
: 所有连接都是反向的。
: 目前的情况是质粒没法做任何改动，只能在insert上做手脚，但问题是不知道症结在哪
: 里从何改其
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m******5
发帖数: 1383 | 3 18个酶切验证阳性的克隆
这个东西plasmid比较大（13k）不太好连，这18个是从200多个克隆里挑出来的……
【在 s******s 的大作中提到】
: 什么叫做所有，你抽了几个？
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s******s
发帖数: 13035 | 4 设计PCR引物cover酶切点，然后colony PCR直接批一个96孔板的
【在 m******5 的大作中提到】
: 18个酶切验证阳性的克隆
: 这个东西plasmid比较大（13k）不太好连，这18个是从200多个克隆里挑出来的……
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m******5
发帖数: 1383 | 5 Do you think there might be some substantial problem I need to circumvent by
other methods?
【在 s******s 的大作中提到】
: 设计PCR引物cover酶切点，然后colony PCR直接批一个96孔板的
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s******s
发帖数: 13035 | 6 colony PCR，有了引物一个上午就解决了。解决不了你再考虑是不是有其他问题
by
【在 m******5 的大作中提到】
: Do you think there might be some substantial problem I need to circumvent by
: other methods?
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d******u
发帖数: 99 | 7 老天。。我刚设计了一个引物，也是打算用Age1 单酶切去做，质粒也差不多13k。。。
【在 m******5 的大作中提到】
: 前的状况是单酶切AGEI,用T4ligase过夜后转化
: 菌系试过DH5alpha和Top 10。
: 所有连接都是反向的。
: 目前的情况是质粒没法做任何改动，只能在insert上做手脚，但问题是不知道症结在哪
: 里从何改其
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m******5
发帖数: 1383 | 8 这个事情概率很小的，别担心，我用这个质粒连了几个东西，只有这个遇到了全部反向
的情况，之前做了几个都是各半，还有一个是全部正向，当时觉得有什么问题但只觉得lucky，结果报应来了……
【在 d******u 的大作中提到】
: 老天。。我刚设计了一个引物，也是打算用Age1 单酶切去做，质粒也差不多13k。。。
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s*******e
发帖数: 1010 | 9 貌似单酶切链接总是反向连接产物多一些，似乎携带无意义编码的DNA的质粒总是比有
意义的具有生存优势。colony PCR几乎是必须的后续手段，酶切鉴定我一般都不做。 |
b****r
发帖数: 17995 | 10 很有道理，学习了。不过再转念一想，这些东西应该基本不是能在原核表达的啊，难道
仍然能被微量表达？
【在 s*******e 的大作中提到】
: 貌似单酶切链接总是反向连接产物多一些，似乎携带无意义编码的DNA的质粒总是比有
: 意义的具有生存优势。colony PCR几乎是必须的后续手段，酶切鉴定我一般都不做。
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s*******e
发帖数: 1010 | 11 前面挂着细菌/噬菌体启动子的DNA很好理解，但是很多时候CMV或者昆虫启动子所驱动
的DNA片段也有这个现象，我也很费解。
【在 b****r 的大作中提到】
: 很有道理，学习了。不过再转念一想，这些东西应该基本不是能在原核表达的啊，难道
: 仍然能被微量表达？
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y*********u
发帖数: 183 | |
b****r
发帖数: 17995 | 13 我有次挑了10多个吧，我记得才100bp，全反的，后来改别的方法clone了
【在 y*********u 的大作中提到】
: 楼上几位都遇到过？
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y*********u
发帖数: 183 | 14 你觉得和去磷酸化与否有关系么？
【在 b****r 的大作中提到】
: 我有次挑了10多个吧，我记得才100bp，全反的，后来改别的方法clone了
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b**********8
发帖数: 349 | 15 我之前做TA的时候也遇到过这样的情况，我要的是反向链接的，不过连续挑了30几个都
是正向的。后来老板告诉我挑克隆的时候注意同时挑一些个头大的菌落和个头小的菌落
。我发现那些个头小的过夜摇菌的时候长的很差，不是那种均匀的浑浊，而是一团白色
的粘糊糊的附着在tip上，其实之前那30个里我也遇到过这样的，当时以为是污染了于
是把菌液丢掉了，没有抽提。最后那次把所有的菌液抽提，经酶切验证发现那些个头小
的摇菌后呈白色团块状的就是我要的。后来猜测估计反相连接的序列可能会在菌体内表
达某些有毒性的蛋白，所以不容易挑到。 |
b****r
发帖数: 17995 | 16 我向来都去磷酸化的
【在 y*********u 的大作中提到】
: 你觉得和去磷酸化与否有关系么？
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b****r
发帖数: 17995 | 17 有意思，又学了个新东西
【在 b**********8 的大作中提到】
: 我之前做TA的时候也遇到过这样的情况，我要的是反向链接的，不过连续挑了30几个都
: 是正向的。后来老板告诉我挑克隆的时候注意同时挑一些个头大的菌落和个头小的菌落
: 。我发现那些个头小的过夜摇菌的时候长的很差，不是那种均匀的浑浊，而是一团白色
: 的粘糊糊的附着在tip上，其实之前那30个里我也遇到过这样的，当时以为是污染了于
: 是把菌液丢掉了，没有抽提。最后那次把所有的菌液抽提，经酶切验证发现那些个头小
: 的摇菌后呈白色团块状的就是我要的。后来猜测估计反相连接的序列可能会在菌体内表
: 达某些有毒性的蛋白，所以不容易挑到。
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